★ 樓瑩 伍娟 王小婷 吳潤華 蔡巧燕 陳沁（.福建中醫(yī)藥大學(xué)臨床技能教學(xué)中心 福州 50；.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州 50；.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 福州 50）

心血管損害是睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS）常 見 嚴(yán)重危害健康的并發(fā)癥；夜間反復(fù)的低氧復(fù)氧造成氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)增多，交感神經(jīng)興奮性增高，是OSAHS心血管損害的重要因素［1］；OSAHS患者患冠心病、心力衰竭和心律失常等疾病的風(fēng)險高于正常人。OSAHS早期心肌損傷在醫(yī)學(xué)上被認(rèn)為是可逆性病變，有效的阻斷、減輕或逆轉(zhuǎn)心肌損傷的進(jìn)程，可在很大程度上改善OSAHS心臟病的預(yù)后，甚至可以預(yù)防失代償心功能衰竭的發(fā)生。因此，開展防治OSAHS心肌損傷的研究對OSAHS心臟病臨床治療具有重要意義。

補(bǔ)陽還五湯（Buyang Huanwu decoction）出自清代醫(yī)家王清任所著《醫(yī)林改錯》，是治療中風(fēng)的經(jīng)典方，臨床上廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療［2-3］，療效確切，并將之列為益氣活血化瘀的代表方。體內(nèi)外研究表明補(bǔ)陽還五湯具有抗氧化、抗炎、抗興奮性氨基酸毒性的作用［4］。課題組前期研究亦表明益氣活血化瘀可改善OSAHS患者氧化應(yīng)激［5］，但其具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過建立間歇低氧大鼠模型，觀察補(bǔ)陽還五湯對模型大鼠miRNA-214/CaMKⅡ氧化應(yīng)激信號通路相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探討中藥對其心肌氧化應(yīng)激的影響及機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 本課題經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗管理委員會批準(zhǔn)，所有試驗均遵照相關(guān)動物保護(hù)和使用指南的規(guī)定實施。選取SPF級健康雄性SD大鼠，體重（200±20）g，購于上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司（生產(chǎn)許可證：SCXK〈滬〉2017-0005），飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)SPF級實驗動物中心（生產(chǎn)許可證：SYXK〈閩〉2016-002）。

1.2 藥材 取中藥黃芪30 g、當(dāng)歸9 g、川芎12 g、赤芍12 g、地龍12 g、桃仁3 g、紅花6 g，飲片置煎煮容器內(nèi)，加相當(dāng)于藥材量5～7倍的冷水浸泡1～2 h，煮沸30 min，過濾。藥渣加3～5倍量水繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，過濾。合并兩次濾液，于水浴上濃縮成每毫升相當(dāng)于原生藥材0.5 g的藥液，冷卻后裝入滅菌藥瓶，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 Tunel 檢測試劑盒（Roche公司，貨號W11684817910）；SOD檢測試劑盒（南京建成生物公司，貨號A001-1）；MDA檢測試劑盒（南京建成生物公司，貨號A003-1）；miRNA-214、CaMKⅡ引物設(shè)計（Servicebio公司）；miRNA-214頸環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（thermo公司，貨號GK1622）；qPCR 試劑盒（Roche公司）；Anti-CaMKⅡ（ABCA公司，貨號ab22609）；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠（武漢谷歌生物科技公司，GB23301）；GAPDH（武漢谷歌生物科技，GB13002-m-1）。

1.4 儀器 ABI 7500Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng)；APC 300電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司）；DU-650 蛋白核酸分析儀（美國Beckman公司）。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備及給藥 隨機(jī)分為常氧組、間歇低氧組、補(bǔ)陽還五湯組，每組8只，間歇低氧組與補(bǔ)陽還五湯組每天9∶00～17∶00置于低氧艙中進(jìn)行間歇性低氧處理制備模型，常氧組在每天同一時間給予常氧，為期8周。低氧艙采用KY-2F型控氧儀進(jìn)行氧濃度的調(diào)控，通過向低氧艙中循環(huán)充入氮?dú)夂脱鯕?，達(dá)到并維持預(yù)定的氧氣濃度，其中最低氧濃度為5.1 %，最高氧濃度為21.0 %。每一循環(huán)周期分為4個階段，即氧濃度下降期（50 s）、低氧維持期（20 s），氧濃度上升期（30 s）、常氧維持期（20 s），共計120 s，用以模擬呼吸暫停低通氣指數(shù)為30次/h的中度OSAHS。暴露開始第一天的同時開始灌胃給藥：中藥組于每天低氧前、后半小時給予方藥灌胃，按方劑飲片合劑量19.2 mL/（kg·d）灌胃。常氧組和間歇低氧組采用等量生理鹽水灌胃，造模期間飲食飲水不限。

2.2 取材 8周后所有大鼠均空腹8 h，3 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈采血后處死，開胸將大鼠心臟完整取出，分離血清，-20 ℃保存；取心室的心肌片段，切片后使其浸泡于4 %多聚甲醛（以pH 7.4的PBS配制）中固定，用于形態(tài)學(xué)觀察。再取數(shù)塊心室肌組織放入液氮中迅速冷凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱用于后續(xù)實驗。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 心臟超聲心動圖檢測 異氟烷麻醉小鼠，稱重，胸部備皮后置于溫墊上，固定四肢并連接電極。麻醉后將小鼠心率控制在400～500次/min進(jìn)行超聲心動圖檢測。應(yīng)用VISUALSONICS小動物超聲儀，寬頻探頭，頻率30 MHz,聚焦深度1.3 cm，采集小鼠心臟的M型超聲心動圖像，測量評價心臟結(jié)構(gòu)和功能的各項參數(shù)。

2.3.2 血清檢測 應(yīng)用化學(xué)比色法檢測大鼠血清SOD、MDA，麻醉后腹主動脈采血，靜置2 h后用離心機(jī)離心10 min（3 000 r /min）取上清，按試劑盒說明書檢測SOD、MDA。

2.3.3 心臟組織病理學(xué)觀察 取心室組織多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，制備石蠟切片，用HE染色，光鏡下觀察心肌組織病理改變。

2.3.4 心肌細(xì)胞凋亡檢測 取大鼠左室心肌組織約120 mg，冰凍切片，用TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡，首先用PBS洗滌玻片，放在37℃濕盒中孵育40 min，用PBS沖洗5次，在其上滴入60熒光底物溶液，室溫孵育40 min，用PBS沖洗 5次，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，樹脂封片。用IPP 6.2圖像分析軟件計數(shù)和熒光顯微鏡拍照。

2.3.5 熒光定量PCR檢測組織中miRNA-214及CaMKⅡ表達(dá)變化 按RNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行，提取總RNA，miRNA-214通過莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按miRNA 熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，以U6為內(nèi)參。CaMKⅡ按普通mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作，按熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，以β-actin 為內(nèi)參。PCR引物序列如表1。實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)通過Ct 比較法進(jìn)行分析，定量（2-△△ct）。

表1 qPCR 引物序列表

2.3.6 Western blot檢測 CaMKⅡ蛋白表達(dá)變化，依照各試劑盒說明書要求，提取大鼠心肌組織的總蛋白，將等量的蛋白（30 mg），在10 %的SDSPAGE中以80 V恒壓電泳35 min，120 V恒壓電泳90 min，切取目的條帶。100 V低溫條件下轉(zhuǎn)膜。在脫脂奶粉封閉液中常溫封閉1 h。用一抗孵育過夜，將膜取出，在TBST中充分洗滌。洗膜后，加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗，常溫孵育1 h。將膜取出，在TBST中洗滌后，使用ECL試劑曝光，用Bio-Rad成像儀拍照，ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值分析，GAPDH作為內(nèi)參。

2.3.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若方差齊，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗，若方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽還五湯對心臟多普勒超聲的影響 超聲檢測發(fā)現(xiàn)與常氧組相比，間歇低氧組大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular endsystolic dimension，LVIDs）數(shù)值增加，射血分?jǐn)?shù)（EF）、心肌縮短分?jǐn)?shù)（FS）數(shù)值下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1和表2，說明心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，心臟擴(kuò)張并出現(xiàn)心臟收縮功能下降。補(bǔ)陽還五湯組與間歇低氧組大鼠對比，LVIDs和LVIDd數(shù)值下降，EF、FS數(shù)值增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1和表2，說明中藥組具有抑制心臟結(jié)構(gòu)改變，保護(hù)心功能的作用。

圖1 補(bǔ)陽還五湯對心臟超聲的影響

表2 補(bǔ)陽還五湯對心臟超聲的影響（±s，n=8）

表2 補(bǔ)陽還五湯對心臟超聲的影響（±s，n=8）

注：與常氧組比較，*P＜0.05；與間歇低氧組比較，**P＜0.05。

組別 EF/% FS/% LVIDd/mm LVIDs/mm補(bǔ)陽還五湯組 75.402±3.400** 45.692±3.082** 7.547±0.743** 4.090±0.479**常氧組 81.188±6.609 51.960±7.142 7.518±0.642 3.606±0.513間歇低氧組 63.644±10.396* 36.505±7.668* 8.442±0.729* 5.379±0.949*

3.2 補(bǔ)陽還五湯對病理組織學(xué)的影響 光鏡下心肌組織病理學(xué)改變：（1）常氧組：心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，間質(zhì)中無炎細(xì)胞浸潤；（2）間歇低氧組：心肌細(xì)胞腫脹，細(xì)胞界限不清，炎癥細(xì)胞浸潤；（3）補(bǔ)陽還五湯組：心肌細(xì)胞形態(tài)正常，伴有少量炎細(xì)胞浸潤。見圖2。

圖2 補(bǔ)陽還五湯對心肌病理組織學(xué)的影響（HE染色 40×）

3.3 補(bǔ)陽還五湯對心肌細(xì)胞凋亡的影響 在熒光鏡下間歇低氧組的大鼠心肌TUNEL綠色熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于常氧組,補(bǔ)陽還五湯組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于間歇低氧組。見圖3。

圖3 補(bǔ)陽還五湯對心肌細(xì)胞凋亡的影響

3.4 補(bǔ)陽還五湯對血清SOD及MDA的影響 與常氧組比較，間歇低氧組血清SOD表達(dá)下降，而MDA表達(dá)升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。與間歇低氧組比較，補(bǔ)陽還五湯組血清抗氧化應(yīng)激作用的SOD顯著增高，而促進(jìn)氧化損傷的MDA明顯下降（P＜0.05），見表3。證實補(bǔ)陽還五湯可調(diào)控間歇低氧誘導(dǎo)的全身氧化應(yīng)激效應(yīng)。

表3 補(bǔ)陽還五湯對SOD和 MDA的影響（±s，n=8）

表3 補(bǔ)陽還五湯對SOD和 MDA的影響（±s，n=8）

注：與常氧組比較，*P＜0.05；與間歇低氧組比較，**P＜0.05。

組別 SOD/kU·L-1 MDA/mol·L-1補(bǔ)陽還五湯組 557.486±23.028** 5.745±0.309**常氧組 566.680±15.676 5.798± 0.321間歇低氧組 425.745±11.185* 8 .629±0.489*

3.5 補(bǔ)陽還五湯對miRNA-214及CaMKⅡmRNA相對表達(dá)量的影響 間歇低氧組miRNA-214相對表達(dá)量顯著低于常氧組（P＜0.05），CaMKⅡmRNA相對表達(dá)量顯著高于常氧組（P＜0.05），與間歇低氧組比較，補(bǔ)陽還五湯組miRNA-214相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），CaMKⅡ顯著降低（P＜0.05），見表4。結(jié)果表明補(bǔ)陽還五湯對miRNA-214及CaMKⅡ表達(dá)有顯著調(diào)控作用。3.6 補(bǔ)陽還五湯對CaMKⅡ蛋白表達(dá)量的影響 與常氧組比較，間歇低氧組CaMKⅡ蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），與間歇低氧組比較，補(bǔ)陽還五湯組CaMKⅡ蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。見圖4和表5。

表4 補(bǔ)陽還五湯對miRNA-214 和CaMKⅡmRNA表達(dá)的影響（±s，n=8）

表4 補(bǔ)陽還五湯對miRNA-214 和CaMKⅡmRNA表達(dá)的影響（±s，n=8）

注：與常氧組比較，*P＜0.05；與間歇低氧組比較，**P＜0.05。

組別 miRNA-214 CaMKⅡ補(bǔ)陽還五湯組 1.506±0.100** 45.692±3.082**常氧組 1.175±0.109 51.960±7.142間歇低氧組 1.864±0.260* 36.505±7.668*

圖4 補(bǔ)陽還五湯對CaMKⅡ蛋白相對表達(dá)量灰度值的影響

表5 補(bǔ)陽還五湯對CaMKⅡ蛋白相對表達(dá)量的影響（ ±s，n=8）

表5 補(bǔ)陽還五湯對CaMKⅡ蛋白相對表達(dá)量的影響（ ±s，n=8）

注：與常氧組比較，*P＜0.05；與間歇低氧組比較，**P＜0.05。

組別 CaMKⅡ補(bǔ)陽還五湯組 0.346±0.084**常氧組 0.125±0.044間歇低氧組 0.484±0.054*

4 討論

OSAHS患者特征性間歇低氧誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，是OSAHS靶器官損傷的重要機(jī)制［6］。OSAHS患者由于反復(fù)發(fā)生上氣道阻塞，而反復(fù)發(fā)生缺氧和再氧合，產(chǎn)生了過多的活性氧（reactive oxygen species，ROS），破壞了氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生［7］，可造成類似心臟缺血-再灌注造成心肌損傷的各種表現(xiàn)。研究表明，在間歇低氧氧化應(yīng)激損傷過程中往往伴隨著心肌細(xì)胞活性氧的過度累積，線粒體功能障礙，從而引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡、壞死等變化，因此如何減少間歇低氧引起的心肌氧化應(yīng)激是預(yù)防心肌細(xì)胞的凋亡、心肌重構(gòu)的重要途徑。

miRNA是一種長約21～23個核苷酸的RNA分子，在真核生物中廣泛存在。研究表明miRNAS可調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的分化、凋亡等生理過程［8］。已發(fā)現(xiàn)多種miRNA與心臟的缺血/缺氧損傷有關(guān)，如心肌缺血/缺氧損傷存在miR-1、miR-29和miR-320的 表 達(dá) 增 高［9-11］，miR-21和miR-24的表達(dá)降低［12-13］。這些miRNA分子與心肌細(xì)胞的纖維化、心肌重構(gòu)及心肌細(xì)胞的凋亡等密切相關(guān)［14］，miRNA-214既為心臟特異性miRNA，也是缺氧誘導(dǎo)型 miRNA［15-17］，研究表明miRNA-214可通過多條信號通路提高心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力［17］，并通過抑制鈉/鈣交換通道1（NCX1）降低氧化應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)鈣負(fù)荷［18］。而miRNA-214發(fā)揮作用需通過調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)，通過Target Scan數(shù)據(jù)庫預(yù)測CaMKⅡ為miRNA-214靶基因，miRNA-214通過3p'-GACGAC-5p'與CaMKⅡmRNA 5p'-CUGCUGA-3p'相互配對,體外細(xì)胞實驗證實miRNA-214 靶向抑制CaMKⅡ［19］。CaMKⅡ是一種受鈣調(diào)蛋白調(diào)控的多功能蛋白激酶［20］，研究發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ已成為許多心臟疾病的關(guān)鍵酶［21］。CaMKⅡ作為Ca2+/CaM調(diào)節(jié)蛋白家族中的一個主要成員，被認(rèn)為是氧化應(yīng)激致心肌重構(gòu)的關(guān)鍵信號之一，此效應(yīng)可能由于活化的CaMKⅡ可誘導(dǎo)鈣離子泄漏通過多途徑促進(jìn)ROS表達(dá)增加進(jìn)一步加重氧化損傷。當(dāng)ROS過度生成并積累時，會導(dǎo)致SOD消耗性降低，同時組織細(xì)胞脂膜發(fā)生過氧化損傷，生成大量MDA，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)一步損害。MDA可通過不同途徑造成組織損傷，并能夠反映機(jī)體受ROS氧化損傷的程度。因而抗氧化治療手段通過阻斷CaMKⅡ與ROS之間聯(lián)通的橋梁，或許能保護(hù)機(jī)體免于心肌氧化應(yīng)激損傷發(fā)生。

本實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組可改善大鼠心臟收縮功能，HE染色顯示可改善大鼠心肌病理損害，此外，補(bǔ)陽還五湯顯著增加miRNA-214 的表達(dá)，從而抑制CaMKⅡ 的表達(dá)，使SOD升高，MDA減少，從而改善心肌氧化應(yīng)激。在細(xì)胞氧化損傷過程中，往往伴隨著細(xì)胞凋亡增加，故本實驗進(jìn)一步采用 TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡狀態(tài)，結(jié)果顯示間歇低氧可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)增加，而補(bǔ)陽還五湯可明顯減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，補(bǔ)陽還五湯可改善間歇低氧大鼠心肌氧化應(yīng)激，抑制心肌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過激活miRNA-214/CaMKⅡ信號通路，miRNA-214可能抑制CaMKⅡmRNA表達(dá)，發(fā)揮改善心肌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激作用。