齊白羽，洪夢(mèng)楠，陳譽(yù)文，李 婧

（錦州醫(yī)科大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

冰酒是典型的甜類葡萄酒，1794年起源于德國(guó)，距今已有200多年的歷史，因其優(yōu)越的感官品質(zhì)被譽(yù)為“葡萄酒皇后”[1]。優(yōu)質(zhì)冰酒的生產(chǎn)需要以經(jīng)過(guò)-8 ℃自然冷凍的冰葡萄為原料[2]，經(jīng)低溫度采摘與壓榨后接種酵母，并在15～17 ℃下進(jìn)行低溫發(fā)酵[3]。近年來(lái)，我國(guó)冰酒產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，遼寧桓仁地區(qū)因其適宜的溫度與獨(dú)特的環(huán)境，成為我國(guó)最大的冰酒產(chǎn)區(qū)，而威代爾是該地區(qū)生產(chǎn)冰酒的主要冰葡萄品種[4]。

酵母在冰酒發(fā)酵過(guò)程中的作用至關(guān)重要，但冰葡萄汁中高濃度的糖、酸以及SO2易為酵母營(yíng)造不利的生長(zhǎng)環(huán)境，因此篩選具備良好耐受性能的優(yōu)良冰酒酵母菌株是必要的[5]。酵母分為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae）。釀酒酵母在葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中可以將葡萄汁中的糖轉(zhuǎn)化為乙醇、二氧化碳與其他代謝產(chǎn)物。然而，接種一些獨(dú)特的非釀酒酵母菌株作為發(fā)酵劑，可以提高葡萄酒的質(zhì)量與穩(wěn)定性，有效增加葡萄酒的香氣復(fù)雜度[6]。相關(guān)研究表明，與釀酒酵母相比，非釀酒酵母具有高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力，該酶可以促進(jìn)葡萄果實(shí)中C13-降異戊二烯類、單萜烯、倍半萜醇和脂肪醇等糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的釋放[7-8]。戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）是釀酒中常見(jiàn)的非釀酒酵母之一，其在具有產(chǎn)酶能力的同時(shí)，還可在含高濃度糖的葡萄酒中產(chǎn)生低含量的乙酸、乙醛和高含量的果味酯和萜烯類香氣化合物[9-10]，并減少異味副產(chǎn)物的產(chǎn)生[11]。

因此，本研究以威代爾冰酒自然發(fā)酵過(guò)程中分離出的10株戴爾有孢圓酵母菌株為研究對(duì)象，對(duì)其葡萄糖、酒精、酸、SO2耐受性能及產(chǎn)β-葡萄糖苷酶性能進(jìn)行測(cè)定分析，篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母，并將篩選菌株與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ST混合發(fā)酵冰葡萄汁，并對(duì)冰葡萄酒的基本理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，以期為獲得可應(yīng)用于冰葡萄酒釀造的優(yōu)良本土戴爾有孢圓酵母提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

威代爾冰葡萄汁：于2017年12月采集自遼寧省五女山米蘭酒業(yè)有限公司（北緯41°17′53.53″、東經(jīng)125°22′27.26″）。理化指標(biāo)：pH值為4.03，總糖含量為432.97 g/L，可滴定酸（以酒石酸計(jì)）含量為4.98 g/L。

1.1.2 菌株

本土戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）菌株（編號(hào)為TD1、TD2、TD3、TD4、TD5、TD6、TD7、TD8、TD9、TD10）：分離自威代爾冰酒的自然發(fā)酵前期[12]，保存于錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ST：法國(guó)Laffort公司。

1.1.3 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；柑橘果膠、對(duì)硝基苯酚、氯霉素（均為分析純）：北京索萊寶生物科技有限公司；熊果苷、木聚糖、檸檬酸鐵銨（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技有限公司；生理鹽水、酒石酸、亞硫酸、酒精（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

無(wú)氨基酵母氮源（yeastnitrogenbase withoutaminoacids，YNB）培養(yǎng)基：青島海博生物有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基[5]：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L。

β-葡萄糖苷酶活性篩選培養(yǎng)基[13]：YNB培養(yǎng)基6.7 g/L、熊果苷5 g/L、瓊脂20 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。滅菌后添加2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸鐵銨溶液。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基[13]：YNB培養(yǎng)基10 g/L、木聚糖2%，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[14]：酵母浸粉5 g/L、酸水解酪蛋白5 g/L、葡萄糖50 g/L、磷酸二氫鉀0.55 g/L、氯化鉀0.425 g/L、氯化鈣0.125 g/L、硫酸鎂0.125 g/L、氯化鐵0.002 5 g/L、硫酸錳0.002 5 g/L、溴甲酚綠0.022 g/L、瓊脂17 g/L、pH值5.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C型精密酸度計(jì)：上海虹益儀器儀表有限公司；SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；YSQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠；TG16KII臺(tái)式高速離心機(jī)：濟(jì)南福的機(jī)械有限公司；M4-AL204型電子分析天平：蘭州中西儀器有限公司；ND-1000微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；LC-15C型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；GC-9790Plus氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：浙江福立分析儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

將受試酵母菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基，于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，使各菌液的細(xì)胞濃度達(dá)到107CFU/mL（OD600nm=1.0），之后稀釋10倍，獲得細(xì)胞濃度為106CFU/mL的酵母菌稀釋液作為種子液，備用。

1.3.2 菌株耐受性的測(cè)定

為考察菌株對(duì)葡萄糖、乙醇、酸及SO2的耐受性，將酵母種子液按5%（V/V）的接種量分別接種于含不同質(zhì)量濃度葡萄糖（300 g/L、350 g/L、400 g/L、450 g/L、500 g/L）[15]、不同體積分?jǐn)?shù)乙醇（4%、8%、10%、12%、14%）[16]、不同質(zhì)量濃度酒石酸（4 g/L、8 g/L、12 g/L、16 g/L、20 g/L）[17]和不同質(zhì)量濃度SO2（100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、350 mg/L）[18]的YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h后，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶性能的測(cè)定

定性分析：將酵母菌種子液稀釋10倍后涂布于β-葡萄糖苷酶活性篩選培養(yǎng)基上，于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d，具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株周圍會(huì)產(chǎn)生深棕色的水解圈[19]。

定量分析：按5%的接種量將酵母種子液接種于YPD培養(yǎng)基中，28 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h后，11 000×g離心10 min，收集酵母細(xì)胞。以106CFU/mL的接種量接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，28 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，11 000×g離心10 min后，分別收集酵母菌細(xì)胞和上清液。采用0.2 mol/L檸檬酸-0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 5.0）洗滌兩次酵母菌細(xì)胞后重懸，用于細(xì)胞壁上β-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定；而上清液則用于細(xì)胞外β-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定[20]。

1.3.4 冰葡萄汁發(fā)酵試驗(yàn)

在250 mL無(wú)菌三角瓶中，裝入180 mL冰葡萄汁后加入50 mg/L SO2，70 ℃加熱20 min，于18 ℃條件下靜置發(fā)酵30 d，每隔24 h稱質(zhì)量，連續(xù)3 d質(zhì)量恒定代表發(fā)酵結(jié)束。共進(jìn)行3組發(fā)酵試驗(yàn)，分別設(shè)置2個(gè)混菌發(fā)酵處理組，1個(gè)純種發(fā)酵處理組，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。其中，在混菌發(fā)酵組中，分別于葡萄汁中接種篩選出的戴爾有孢圓酵母菌TD6與TD9，48 h后順序接種釀酒酵母ST，且初始接種量均為106CFU/mL。在純種發(fā)酵組中只接種釀酒酵母ST。

1.3.5 冰葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中酵母菌發(fā)酵速率變化

在冰酒的發(fā)酵過(guò)程中，每隔24 h稱質(zhì)量以監(jiān)測(cè)CO2的質(zhì)量損失[21]。

1.3.6 冰葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中酵母菌的生長(zhǎng)情況

分別在每組冰葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中的第0天、2天、4天、7天、14天、21天和30天取樣，經(jīng)生理鹽水適當(dāng)稀釋后涂布于WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于28 ℃條件下靜置培養(yǎng)5 d[12]。根據(jù)不同菌落顏色和形態(tài)[16]的區(qū)別，分別對(duì)戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.7 冰葡萄酒基本理化指標(biāo)的測(cè)定

冰葡萄汁發(fā)酵結(jié)束后取樣，測(cè)定冰葡萄酒的基本理化指標(biāo)。

總糖含量的測(cè)定：參考國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒果酒分析方法》；酒石酸、乙酸含量的測(cè)定：采用HPLC法[21]；乙醇含量的測(cè)定：采用GC法[22]。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行基本處理和作圖，試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示；使用SPSS17.0進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的耐受性

10株本土戴爾有孢圓酵母菌對(duì)葡萄糖、乙醇、酒石酸及SO2的耐受性見(jiàn)圖1。

圖1 10株本土戴爾有孢圓酵母菌對(duì)葡萄糖、乙醇、酒石酸及SO2的耐受性測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination results of tolerance to glucose,ethanol,acid and SO2 of 10 strains of Torulaspora delbrueckii

由圖1可知，隨著葡萄糖、乙醇、酒石酸以及SO2含量的升高，大部分戴爾有孢圓酵母菌株的OD600nm值呈下降趨勢(shì)。根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》的規(guī)定，冰酒的酒精度在9.0%vol～14.0%vol、乙酸質(zhì)量濃度≤2.1 g/L、葡萄糖質(zhì)量濃度≥125 g/L。除了菌株TD2外，所有戴爾有孢圓酵母菌株均可以耐受質(zhì)量濃度為500 g/L的葡萄糖，體積分?jǐn)?shù)為4%的乙醇，質(zhì)量濃度為20 g/L的酒石酸以及質(zhì)量濃度為350 mg/L的SO2；尤其是戴爾有孢圓酵母菌株TD3、TD4、TD6、TD7、TD8及TD10可以耐受體積分?jǐn)?shù)為8%的乙醇。綜上可知，除菌株TD2外，其他所有的受試戴爾有孢圓酵母菌株均能夠耐受冰酒發(fā)酵過(guò)程中高糖、高酸環(huán)境以及一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，具有應(yīng)用于冰酒發(fā)酵的潛力。

2.2 菌株的β-葡萄糖苷酶活性分析

2.2.1 定性分析

10株戴爾有孢圓酵母菌株的β-葡萄糖苷酶活性的定性分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 10株戴爾有孢圓酵母菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的定性分析結(jié)果Table 1 Qualitative analysis results of β-glucosidase produced by 10 strains of Torulaspora delbrueckii

由表1可知，10株菌株中只有戴爾有孢圓酵母菌株TD3、TD4、TD6、TD7、TD9、TD10具有β-葡萄糖苷酶活性。因此，對(duì)初步篩選出具有β-葡萄糖苷酶活性的6株戴爾有孢圓酵母菌株進(jìn)行酶活性定量分析。

2.2.2 定量分析

β-葡萄糖苷酶可分布于細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞壁上。發(fā)酵過(guò)程中，在酵母不發(fā)生自溶的情況下，通常僅有細(xì)胞外的酶有能力作用于香氣前體物質(zhì)并產(chǎn)生香氣。在發(fā)酵前期，大部分酵母細(xì)胞易懸浮于發(fā)酵液中，因此細(xì)胞壁結(jié)合酶對(duì)葡萄酒香氣物質(zhì)的釋放也會(huì)產(chǎn)生一定的積極作用[13]。

由圖2可知，6株戴爾有孢圓酵母菌株均具有細(xì)胞外及細(xì)胞壁上的β-葡萄糖苷酶活力。其中，戴爾有孢圓酵母菌株TD3、TD6、TD9及TD10細(xì)胞壁上的β-葡萄糖苷酶活力明顯優(yōu)于菌株TD4與TD7，尤其是菌株TD6與TD9，其細(xì)胞壁上的酶活力分別高達(dá)23.21 U/mL與31.13 U/mL。此外，相對(duì)于菌株TD3、TD4、TD10，菌株TD6與TD9還具備相對(duì)較高的細(xì)胞外β-葡萄糖苷酶活性，分別為2.835 U/mL和4.635 U/mL。綜上可知，菌株TD6和TD9具備良好的產(chǎn)細(xì)胞外以及細(xì)胞壁上β-葡萄糖苷酶的能力，因此，將菌株TD6和TD9應(yīng)用于冰葡萄酒釀造。

圖2 6株戴爾有孢圓酵母菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的定量分析結(jié)果Fig.2 Quantitative analysis results of β-glucosidase produced by 6 strains of Torulaspora delbrueckii

2.3 冰葡萄汁混菌發(fā)酵

2.3.1 冰葡萄汁混菌發(fā)酵過(guò)程中酵母菌株發(fā)酵速率的變化

由圖3可知，3個(gè)發(fā)酵組均能夠在30 d內(nèi)完成酒精發(fā)酵，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中的CO2質(zhì)量損失變化趨勢(shì)一致?；炀l(fā)酵組TD6/ST與TD9/ST在發(fā)酵過(guò)程中CO2的質(zhì)量損失顯著低于純種發(fā)酵組ST（P＜0.05），這說(shuō)明戴爾有孢圓酵母的接種會(huì)對(duì)酒精發(fā)酵速率產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。然而，HRANILOVIC A等[23]研究發(fā)現(xiàn)，非釀酒酵母參與的混合發(fā)酵可以在保證發(fā)酵及時(shí)完成的前提下，通過(guò)提高葡萄酒的品質(zhì)來(lái)彌補(bǔ)其發(fā)酵速率相對(duì)緩慢的問(wèn)題，此外，控制相對(duì)平緩的發(fā)酵速率不僅可以提高香氣代謝物的保留率，還可以有效節(jié)約能源，以防止發(fā)酵劇烈損壞容器[24]。

圖3 冰葡萄汁混菌發(fā)酵過(guò)程中酵母菌發(fā)酵速率的變化Fig.3 Change of yeast fermentation rate during mixed fermentation of ice-grape juice

2.3.2 冰葡萄汁混菌發(fā)酵過(guò)程中酵母菌的生長(zhǎng)情況

由圖4可知，在混菌發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，釀酒酵母ST的菌體濃度均呈先上升趨勢(shì)，直到第14天菌體濃度分別達(dá)到最大值，菌體濃度對(duì)數(shù)值分別為7.48與7.20，隨后，菌體濃度開(kāi)始下降直至發(fā)酵結(jié)束。混菌發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母ST的菌體濃度均低于純種發(fā)酵，說(shuō)明戴爾有孢圓酵母菌株的加入對(duì)釀酒酵母ST的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。在混菌發(fā)酵過(guò)程中，菌株TD6與TD9的菌體濃度也先呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且均于第4天達(dá)到最大值，菌體濃度對(duì)數(shù)值分別為7.5與7.6。然而，在釀酒酵母ST接種48 h后，它們的菌體濃度迅速下降，甚至在發(fā)酵結(jié)束時(shí)不能被檢測(cè)到。此外，兩個(gè)混菌發(fā)酵組中釀酒酵母ST的細(xì)胞濃度均在第14天超過(guò)了戴爾有孢圓酵母TD6與TD9，同時(shí)，釀酒酵母ST開(kāi)始逐漸占據(jù)各自發(fā)酵過(guò)程中的主導(dǎo)地位。針對(duì)戴爾有孢圓酵母細(xì)胞濃度早期下降的現(xiàn)象，可能與發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母與非釀酒酵母之間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)或細(xì)胞間的接觸機(jī)制有關(guān)[21，25]。

圖4 冰葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中酵母菌TD6（A）及TD9（B）的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth of yeast TD6 (A) and TD9 (B) during fermentation process of ice-grape juice

2.3.3 冰葡萄酒基本理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

過(guò)高的乙酸含量不僅不利于冰酒香氣產(chǎn)生，還會(huì)降低冰酒的品質(zhì)。由表2可知，與釀酒酵母ST的純種發(fā)酵相比，接種兩株戴爾有孢圓酵母可以明顯降低乙酸的含量（P＜0.05），這與ALBERGARIA H等[26-27]的研究結(jié)果一致。與菌株TD9相比，菌株TD6降低乙酸含量的效果更好。此外，混菌發(fā)酵組冰酒中總糖含量更高，而酒精度較低，這與CO2質(zhì)量損失的動(dòng)態(tài)變化一致。3組冰酒中乙酸含量均＜2.10 g/L，均符合國(guó)標(biāo)GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》的規(guī)定，這表明將篩選出的兩株優(yōu)良戴爾有孢圓酵母菌株TD6、TD9應(yīng)用于冰葡萄酒釀造，具有高度可行性。

表2 冰酒的基本理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of basic physical and chemical indexes of icewine

3 結(jié)論

10株戴爾有孢圓酵母菌中除菌株TD2外，其他菌株均能夠耐受葡萄糖500 g/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)4%、酒石酸16 g/L及SO2350 mg/L，其中菌株TD6與TD9產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力較高，為優(yōu)良本土戴爾有孢圓酵母。將菌株TD6、TD9分別與釀酒酵母ST混合發(fā)酵冰葡萄汁時(shí)均能在30 d完成酒精發(fā)酵，且冰葡萄酒的基本理化指標(biāo)均符合國(guó)標(biāo)GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》規(guī)定。此外，戴爾有孢圓酵母的接種對(duì)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的發(fā)酵速率與釀酒酵母的生長(zhǎng)起到了一定的抑制作用，并且可以降低冰葡萄酒中乙酸和乙醇含量，提高總糖含量。