毛見智 ，劉曉會(huì)

（上海工程技術(shù)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，上海 201620）

羅勒(Ocimum basilicum L.)為唇形科羅勒屬植物，又名九層塔、甜羅勒，主要分布于東半球熱帶地區(qū)，我國西南多個(gè)省區(qū)均有分布. 其藥理作用主要表現(xiàn)為抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗血栓、抗消化道潰瘍以及降糖、降脂等[1]. 羅勒全草具有強(qiáng)烈的芳香氣味，為主要芳香油植物之一，其揮發(fā)油是一種淡黃至黃色透明液體，臨床用于治療心虛、房顫、動(dòng)脈硬化、高血壓、高血脂、頭痛、咳嗽、腹瀉等[2]， 對(duì)細(xì)菌和真菌均有較好地抑制作用[3].羅勒揮發(fā)油類成分性質(zhì)不穩(wěn)定，很容易變質(zhì)失效，水溶性差. 本研究將羅勒揮發(fā)油制備成包合物，以防止揮發(fā)油揮散，增加其穩(wěn)定性及水溶性，并進(jìn)一步研究包合物的抗菌能力，從而為羅勒揮發(fā)油藥理活性的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，使豐富的羅勒資源得到更充分地利用和更好地開發(fā).

1 儀器與試劑

1.1 儀器

實(shí)驗(yàn)儀器：光學(xué)顯微鏡，上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；恒溫磁力攪拌器，鞏義市科瑞儀器有限公司；TC-15套式恒溫箱，海寧市新華醫(yī)療器械廠；紫外分光光度儀，上海元析儀器有限公司；Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司.

1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)材料：揮發(fā)油(自制)，羥丙基-β-環(huán)糊精（上海源葉生物科技有限公司），蒸餾水，無水硫酸鈉（阿拉丁試劑公司），大腸桿菌ATCC 8739、金黃色葡萄球菌B696和白色念珠菌Y167，購自上海工微所科技股份公司，由本實(shí)驗(yàn)室保存.

2 實(shí)驗(yàn)方法與流程

2.1 揮發(fā)油提取

揮發(fā)油提取采用水蒸氣蒸餾法. 取50 g羅勒碎葉于1 L蒸餾燒瓶中；加入約400 mL蒸餾水，沒過碎葉；將蒸餾燒瓶放入電熱套中加熱，接回流提取裝置，蒸餾提取6～8 h；待揮發(fā)油收集器中不再有揮發(fā)油增加后停止加熱[4?6]，將裝置冷卻至室溫；從收集器中收取淡黃色油狀液體，用無水硫酸鈉干燥.

2.2 包合物制備

稱取羥丙基-β-環(huán)糊精1 g，置于100 mL錐形瓶中；加入20 mL蒸餾水，加熱溶解，制備飽和水溶液；轉(zhuǎn)移至恒溫磁力攪拌器中，攪拌過程逐滴加入0.25 mL揮發(fā)油(等量無水乙醇溶解)；在轉(zhuǎn)速300 rpm/min、溫度40 ℃下進(jìn)行包合，包合時(shí)間為2 h；待其冷卻至室溫后，分次加入5 mL石油醚；用分液漏斗分液除去未包合的揮發(fā)油，下層液體冷凍干燥，即得羅勒揮發(fā)油-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，稱量，最后得到0.66 g包合物.

2.3 含油量測(cè)定(紫外分光光度法)[7]

2.3.1 方法學(xué)考察

精密稱取羅勒揮發(fā)油約0.05 g，置于10 mL的容量瓶中，加入無水乙醇定容、搖勻，再將溶液稀釋100倍，即得所需的揮發(fā)油待測(cè)溶液. 再精密稱取羥丙基-β-環(huán)糊精0.5 g，放入50 mL容量瓶中，加入無水乙醇定容、搖勻、過濾，取濾液稀釋10倍，即得所需的環(huán)糊精待測(cè)溶液. 精密稱取包合物約0.1 g，精密加入15 mL無水乙醇，超聲30 min后過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加入無水乙醇定容、搖勻，再將溶液稀釋10倍，即得所需的包合物待測(cè)溶液. 以無水乙醇溶液為空白對(duì)照，將所配置好的3種待測(cè)溶液于200～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描. 掃描結(jié)果顯示：揮發(fā)油、包合物提取液在波長(zhǎng)為277 nm處均有最大吸收，吸收相似；而羥丙基-β-環(huán)糊精提取溶液在此處沒有吸收，故羥丙基-β-環(huán)糊精并不干擾測(cè)定結(jié)果，因此選定277 nm為檢測(cè)波長(zhǎng).

2.3.2 線性關(guān)系考察

精密稱取約0.5 g的羅勒揮發(fā)油置于100 mL的容量瓶中，加無水乙醇定容至100 mL，搖勻，再從中吸取1 mL溶液置于50 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至50 mL，搖勻，并以此作為對(duì)照溶液. 另外再從100 mL的容量瓶中分別吸取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 mL溶液置于10 mL的容量瓶中，加無水乙醇定容后搖勻. 將對(duì)照溶液與這7種已配制好的溶液稀釋75倍后，于檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm處測(cè)定它們的吸光度（A），并以吸光度對(duì)揮發(fā)油的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性擬合.

最終吸光度對(duì)揮發(fā)油的質(zhì)量濃度的線性擬合結(jié)果為y＝36 002x?0.023 5，r＝0.999 5. 根據(jù)結(jié)果可知，吸光度值在 6×10?6～1.8×10?5g/mL的質(zhì)量濃 度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系.

2.3.3 含油量測(cè)定

為進(jìn)一步測(cè)定包合物的包合效果，需要對(duì)包合物的揮發(fā)油含量進(jìn)行測(cè)定. 首先配制好20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液備用. 精密稱取包合物0.1 g，加入15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 60%的乙醇溶液溶解，超聲30 min后過濾，取濾液于波長(zhǎng)為277 nm下測(cè)定其吸光度，得到吸光度值為0.915 7. 代入擬合的線性方程可以得出對(duì)應(yīng)的揮發(fā)油質(zhì)量濃度為1.4×10?5g/mL. 由此計(jì)算出包合物的含油量、包合率、收率、含油率等，公式[8]為

將所得數(shù)據(jù)代入式（1）進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表1.

表 1 羥丙基-β-環(huán)糊精包合結(jié)果Table 1 Inclusion results of Hydroxypropyl- β- Cyclodextrin

2.3.4 精密度實(shí)驗(yàn)

從2.3.2節(jié)的對(duì)照液中精密吸取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 mL溶液置于10 mL容量瓶中，按照2.3.1節(jié)中的方法用無水乙醇定容，于檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)5次. 最終得結(jié)果為0.075、0.077、0.074、0.078和0.075，平均值約為0.076. 測(cè)得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard D eviation，RSD）為1.08%，表明實(shí)驗(yàn)儀器精密度良好.

2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取0.1 g包合物，用15 mL無水乙醇溶液溶解，于277 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，重復(fù)5次，最終得結(jié)果為1.884、1.885、1.903、1.898和1.900，平均值為1.894，測(cè)得其RSD為0.47%，表明 該方法重復(fù)性較好.

2.3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取羥丙基-β-環(huán)糊精包合物約0.2 g，含油量已知，加入無水乙醇，超聲30 min后過濾. 取濾液并分為3組，每組3份，再按照50%、100%、150%的比例分別將揮發(fā)油加入到溶液中. 將溶液于檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm處測(cè)定吸光度值，3組吸光度值的平均值分別為1.330、1.805和2.030. 代入線性曲線中求出含油量，最后求出的加樣回收率平均值為92.25%，RSD值為0.2%，結(jié)果顯示，回收率與 RSD值均在允許范圍內(nèi).

2 .4 包合物質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.4.1 顯微鏡觀察法

在顯微鏡下觀察羥丙基-β-環(huán)糊精、包合物和羅勒揮發(fā)油與羥丙基- β-環(huán)糊精的物理混合物，結(jié)果如圖1所示. 由圖可知，羥丙基-β-環(huán)糊精在顯微鏡下呈塊狀結(jié)晶；包合物為黑色粉末狀物質(zhì)，未見明顯油漬；物理混合物為表面含有油漬的塊狀物質(zhì)，細(xì)小油滴和結(jié)晶并存，表明其物相未發(fā)生改變，也未形成新物質(zhì)，只是簡(jiǎn)單的物理混合.

圖 1 顯微成像圖Fig. 1 Microscope image

2.4.2 薄層色譜法

精密稱取約0.03 g的羅勒揮發(fā)油，加入3 mL的石油醚溶液溶解備用；稱取0.05 g的環(huán)糊精，加入3 mL的石油醚溶液溶解備用. 另外再稱取0.1 g的包合物兩份：一份直接加入石油醚溶解備用；另一份用無水乙醇溶解之后超聲、過濾、旋干，然后再用石油醚溶液復(fù)溶. 以正己烷∶乙酸乙酯=9∶1為展開劑，展開、晾干，噴以5%質(zhì)量濃度的香草醛濃硫酸，烘干至斑點(diǎn)顯色清晰，結(jié)果如圖2所示.

圖 2 薄層色譜圖Fig. 2 TLC chromatogram of samples

2.5 抑菌圈實(shí)驗(yàn)

將受試菌種接種于固體培養(yǎng)基中，37 ℃下分別活化24 和48 h. 用接種環(huán)挑取活化后的菌苔置于生理鹽水中，分別制成質(zhì)量濃度105～106CFU/mL的菌懸液，備用. 將直徑0.6 cm的無菌圓形濾紙片浸入質(zhì)量濃度為944 mg·mL?1的包合物水溶液中備用. 取菌懸液100 μL均勻涂抹在培養(yǎng)基平皿表面，用無菌鑷子將濾紙片貼在含菌平皿上，以羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液為空白對(duì)照. 37 ℃下培養(yǎng)24 h，測(cè)定濾紙片的抑菌圈直徑[9]，每個(gè)平皿重復(fù)3次，結(jié)果見表2.

表2 包合物抑菌圈直徑Table 2 Inhibition zone of inclusion complex cm

2.6 最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)

在5 mL小試管中依次加入液體培養(yǎng)基1 mL，吐溫80試劑（體積濃度10%）100 μL，菌懸液50 μL，分別添加不同體積的羅勒揮發(fā)油和羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，每次添加時(shí)均充分震蕩試管，于搖床中在37 ℃、180 rpm/min（白色念珠菌，28 ℃，180 rpm/min）條件下培養(yǎng)24 h后，觀察試管內(nèi)菌液澄清度的變化，將與空白培養(yǎng)基澄清度基本一致的質(zhì)量濃度定義為最小抑菌濃度. 由結(jié)果可知，包合物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的最小抑菌濃度分別為3.79、8.58和3.79 mg/mL. 羅勒揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的最小抑菌濃度分別為5、10和5 mg/mL.

3 結(jié) 語

本研究選擇能極大提高水中溶解度的羥丙基-β -環(huán)糊精作為包合材料對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行包合. 實(shí)驗(yàn)中采用紫外分光光度法能快速、準(zhǔn)確地對(duì)羅勒揮發(fā)油羥丙基-β-環(huán)糊精包合物進(jìn)行含油量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示包合率為2.82%，收率為53.23%，含油率為1.02%，含油量較之前報(bào)道有所提高[10]. 顯微鏡、薄層色譜法（TLC）和紅外光譜表征顯示包合物已成功形成，而且包合狀態(tài)良好. 同時(shí)，該方法操作方便、儀器簡(jiǎn)單，對(duì)提高該制劑中揮發(fā)油的穩(wěn)定性有著積極意義.

抑菌實(shí)驗(yàn)表明，包合物和羅勒揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均有一定的抑菌活性，前者的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為3.79 、8.58 和3.79 mg/mL，后者的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為5、10和5 mg/mL. 包合物最小抑菌質(zhì)量濃度比羅勒揮發(fā)油稍小，其可能的原因是復(fù)合材料充分溶解在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，擴(kuò)大了活性成分和微生物的接觸面.