張健強(qiáng)

（德興市人民醫(yī)院外一科神經(jīng)外科，江西 上饒 334200)

羅布麻是一種在我國北方地區(qū)廣泛分布的野生植物，特別是在新疆和甘肅地區(qū)較常見[1]。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上，羅布麻已被用以治療高血壓、心力衰竭、水腫和感冒等病癥，其不良反應(yīng)較小，對身體無明顯危害，也用作保健茶飲[2-3]。植物多酚作為一類生物活性物質(zhì)，已經(jīng)被證實具有抗癌、抗炎、延緩衰老、保護(hù)內(nèi)臟組織等功效[4]。因天然植物多酚的良好生物活性作用，經(jīng)過現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)開發(fā)，已有包括EGCG 在內(nèi)的多種多酚物質(zhì)被應(yīng)用于制造藥物[5]。大腦是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的核心部位，是人體最復(fù)雜的組織系統(tǒng)，大腦受損后對人體意識、行動、生理活動等均有直接影響，甚至威脅生命安全[6]。人體內(nèi)臟或組織發(fā)生損傷后，機(jī)體的氧化應(yīng)激平衡被打破，造成氧化應(yīng)激失衡，會加劇組織損傷[7]。本研究提取羅布麻多酚，通過建立動物腦損傷模型，觀察羅布麻多酚對腦損傷小鼠認(rèn)知的恢復(fù)作用及氧化應(yīng)激失衡的抑制作用，旨在為羅布麻多酚的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡SPF級C57BL/c小鼠40只（體質(zhì)量20～22 g），雌雄各20只，均購自于江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心。

1.2 試劑 羅布麻購自杭州聚修堂健康科技有限公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；SOD、GSHPx、MDA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白測定盒購自天根生化科技有限公司，SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠、PVDF膜購自美國Invitrogen公司；一抗、二抗購自美國Abcam公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備 BW-MWM101morris 水迷宮由上海軟隆科技發(fā)展有限公司提供；UV9600紫外分光光度計購自北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）公司；LUX 多功能性酶標(biāo)儀購自美國賽默飛公司；LAS3000成像系統(tǒng)購自日本富士公司。

1.4 方法

1.4.1 羅布麻多酚的提取 將冷凍干燥后的羅布麻磨碎后，稱取500 g 的羅布麻粉末，加入4.5 L 的純水，攪拌狀態(tài)下進(jìn)行水浴提取（90 ℃，30 min），重復(fù)提取2次，收集濾液得到粗提液。然后將粗提液過HP20 大孔樹脂進(jìn)行大孔樹脂吸附，完成吸附后用70%（v/v）的乙醇洗脫，最后得到羅布麻多酚提取液[8]。

1.4.2 羅布麻多酚的純度測定 稱取20 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，加入2 mL 的純水配制成綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液，然后稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品液，再分別取1.0 mL 的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品液加于25 mL 容量瓶中，然后再加入Folin-Ciocalteu 試劑（3.0 mL）與標(biāo)準(zhǔn)品液反應(yīng)5 min，之后再加入4.5 mL飽和的Na2CO3溶液于容量瓶中，最后加純水定容。室溫下避光反應(yīng)20 min后在747 nm 處測定反應(yīng)液的吸光度值，根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品液和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將樣品提取液重復(fù)以上步驟測定吸光度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到羅布麻多酚的含量[9]。

1.4.3 分組 40只實驗小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、羅布麻多酚低濃度灌胃（AVPL）組和羅布麻多酚高濃度灌胃（AVPH）組，每組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，對除正常組外其他小鼠進(jìn)行麻醉（2%戊巴比妥鈉，50 mg/kg），然后將小鼠固定于手術(shù)臺上，用脫毛膏脫去小鼠頸部的毛，仔細(xì)觀察后準(zhǔn)確對頸外動脈遠(yuǎn)端進(jìn)行結(jié)扎，再在頸外動脈遠(yuǎn)心端用手術(shù)剪刀剪出約5 mm小口，用尼龍線由小口插入，輕輕推進(jìn)尼龍線，直至不能推進(jìn)為止進(jìn)行固定，對小鼠進(jìn)行缺血處理30 min，然后抽出尼龍線進(jìn)行灌注，建立小鼠腦損傷模型[10]。造模24 h 后觀察有無出現(xiàn)死亡情況，然后對AVPL 組和AVPH 組小鼠分別灌胃100、200 mg/kg AVP，持續(xù)4周，然后進(jìn)行后續(xù)測定。

1.4.4 空間學(xué)習(xí)和記憶能力評估 將水迷宮的圓形池平均劃分為4 個象限，小鼠開始灌胃AVP 的首日記錄為第1 天，然后在第24 天開始每天訓(xùn)練小鼠尋找圓形池中的隱藏平臺，將小鼠放在4個象限的相同位置，促使小鼠找尋平臺，直至找到為止，每次找尋時間為60 s，記錄小鼠停留在平臺所在象限的時間，每天訓(xùn)練1 次，持續(xù)4 d。第28 天，灌胃AVP后6 h，撤去圓形池中的平臺，記錄小鼠在平臺所在象限停留時間和穿越平臺次數(shù)[11]。

1.4.5 新物體識別實驗 選取10 m×10 m 的空曠場地作為小鼠訓(xùn)練場，小鼠開始灌胃AVP 的首日記錄為第1 天，然后在第24天開始每天訓(xùn)練，將小鼠放入訓(xùn)練場中，使其自由活動，適應(yīng)和熟悉試驗場，每天訓(xùn)練10 min。第28 天，完成后進(jìn)行2次識別實驗，每次5 min。第1次在訓(xùn)練場中選擇2個區(qū)域放置20 cm×20 cm的正方體物體讓小鼠識別，第2次在訓(xùn)練場中和第1次實驗相同區(qū)域放置1個與之前相同的正方體，另外再放置1 個高度同樣為20 cm 的三角體。記錄2 次實驗小鼠探索每個物體的時間。然后計算小鼠在第2 次實驗中的辨別指數(shù)，即探索新物體（三角體）的時間/探索2個物體的總時間×100%11]。

1.4.6 腦組織指標(biāo)測定 斷頸處死小鼠后，取0.5 g 小鼠腦組織，用PBS 緩沖液洗滌后進(jìn)行勻漿，然后4 000 r/min 離心10 min，吸出上層液用試劑盒檢測小鼠腦組織的SOD 酶活力、GSH-Px酶活力和MDA水平。

1.4.7 Western blot實驗 斷頸處死小鼠后，取0.5 g小鼠腦組織，用PBS緩沖液洗滌后進(jìn)行勻漿，然后加入裂解液進(jìn)行裂解（4 ℃，20 min），進(jìn)行離心分離（4 000 r/min，10 min）,吸出上清液。然后用BCA 蛋白測定盒檢測提取出的蛋白總量。取100 μL（蛋白含量30～50 μg）裂解液進(jìn)行上樣，在SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，然后在PVDF膜上進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜。然后加入能覆蓋轉(zhuǎn)膜的封閉液和稀釋后的一抗，4 ℃下孵育12 h，再進(jìn)行洗膜，加入二抗液后在室溫下孵育1 h，再次洗膜，最后用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行蛋白表達(dá)的顯色[12]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS 9.1統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 羅布麻多酚中多酚物質(zhì)含量分析 通過測定不同濃度下綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品液的吸光度值，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品液濃度為Y軸，吸光度值為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.1946X-0.0004（R2=0.9976）。然后測定AVP 提取液的吸光度值，對照標(biāo)曲線計算，最后得到AVP 的含量為74.75%，純度較高，可進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 4 組小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力比較 模型組逃避潛伏時間長于正常組，穿越平臺次數(shù)少于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；AVPL組和AVPH組逃避潛伏時間均短于模型組，穿越平臺次數(shù)多于模型組，且AVPH 組均優(yōu)于AVPL組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 4組小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力比較（±s）Table 1 Comparison of spatial learning and memory ability of mice among four groups(±s)

表1 4組小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力比較（±s）Table 1 Comparison of spatial learning and memory ability of mice among four groups(±s)

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較bP＜0.05；與AVPL組比較，cP＜0.05

穿越平臺次數(shù)（次）6.37±0.41 1.52±0.26a 2.97±0.25ab 5.18±0.33abc組別正常組（n=10）模型組（n=10）AVPL組（n=10）AVPH組（n=10）逃避潛伏時間（s）24.35±3.25 55.63±5.11a 42.79±3.62ab 35.71±3.34abc

2.3 4組小鼠對新舊物體辨別指數(shù)比較 AVPH組和AVPL組對新舊物體辨別指數(shù)為（51.60±3.39）%和（45.36±3.17）%，明顯高于模型組的（38.79±3.66）%，但低于正常組的（61.28±2.36）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 4組小鼠腦組織SOD、GSH-Px和MDA水平比較 模型組、AVPL 組、AVPH 組SOD、GSH-Px 酶活力均低于正常組，MDA 水平高于正常組，且AVPL 組、AVPH 組SOD、GSH-Px酶活力均高于模型組，MDA水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 4組小鼠腦組織SOD、GSH-Px酶活力和MDA水平比較（±s）Table 2 Comparison of SOD,GSH-Px enzyme activities and MDA level in brain tissue among four groups of mice(±s)

表2 4組小鼠腦組織SOD、GSH-Px酶活力和MDA水平比較（±s）Table 2 Comparison of SOD,GSH-Px enzyme activities and MDA level in brain tissue among four groups of mice(±s)

注：SOD，超氧化物歧化酶；GSH-Px，谷胱甘肽過氧化物酶；MDA，丙二醛

MDA（nmol/L）2.52±0.31 8.89±0.42a 7.36±0.22ab 4.34±0.30abc組別正常組（n=10）模型組（n=10）AVPL組（n=10）AVPH組（n=10）SOD（U/L）187.62±15.67 92.08±8.32a 119.67±6.62ab 143.52±10.95abc GSH-Px（U/L）230.79±16.32 128.43±7.65a 161.37±11.26ab 198.30±12.15abc

2.5 4組小鼠腦組織cAMP和p-CREB蛋白表達(dá)分析 正常組小鼠腦組織的cAMP 和p-CREB 蛋白表達(dá)最強(qiáng)，模型組cAMP和p-CREB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。AVPL組、AVPH組可抑制cAMP和p-CREB蛋白表達(dá)下調(diào)，見圖1。

圖1 4組小鼠腦組織cAMP和p-CREB蛋白表達(dá)分析Figure 1 Analysis of cAMP and p-CREB protein expression in brain tissue among four groups of mice

3 討論

腦損傷引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷后會造成行動異常、認(rèn)知和社會性殘缺等問題[13]。通過小鼠動物模型可以觀察腦損傷造成的行為學(xué)異常，腦損傷會導(dǎo)致小鼠在空間學(xué)習(xí)能力、記憶能力和新物體識別能力出現(xiàn)明顯變化[14]。本研究結(jié)果表明，模型組逃避潛伏時間長于正常組，穿越平臺次數(shù)少于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；AVPL 組和AVPH組逃避潛伏時間均短于模型組，穿越平臺次數(shù)多于模型組，且AVPH 組均優(yōu)于AVPL 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示，AVP作用后，小鼠出現(xiàn)的行為學(xué)缺損被顯著抑制，空間學(xué)習(xí)能力、記憶能力和新物體識別能力均得到一定程度的恢復(fù)。由此可以初步判斷AVP具有修復(fù)腦損傷的作用。

多酚物質(zhì)具有抗氧化效果，能抑制氧化應(yīng)激的效果，從而修復(fù)組織。腦損傷發(fā)生后一般會引起腦組織氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激又會加劇腦損傷[15]。SOD 和GSH-Px 均是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶活力降低時，會加劇組織損傷。MDA 是一些氧化損傷的最終產(chǎn)物，在一定程度上可反映機(jī)體受到氧化應(yīng)激損傷的水平[16]。因此，通過檢測SOD、GSH-Px酶活力和MDA水平可作為檢測機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的評價標(biāo)準(zhǔn)[17]。本研究結(jié)果表明，模型組、AVPL 組、AVPH 組SOD、GSH-Px 酶活力均低于正常組，MDA 水平低于正常組，且AVPL組、AVPH組SOD、GSH-Px酶活力均高于模型組，MDA 水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明小鼠出現(xiàn)腦損傷后，腦組織中的SOD 和GSH-Px酶活力和MDA水平顯著變化，AVP發(fā)揮可多酚物質(zhì)的活性作用，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，修復(fù)腦組織的作用。

cAMP 在機(jī)體中發(fā)揮調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和調(diào)節(jié)生物學(xué)功能的重要作用，特別是其能作為信號傳遞物質(zhì)，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)其他代謝，起到抗組織損傷、抗缺血和抗缺氧的能力[18]。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白作為機(jī)體內(nèi)的調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，是一種特定出現(xiàn)在腦細(xì)胞中的分子，通過刺激特定基因，制造腦組織需要的蛋白質(zhì)，在保持記憶力中發(fā)揮重要作用[19]。cAMP/CREB/BDNF信號通路是保持中樞神經(jīng)正常的重要信號通路，同時，該通路也與學(xué)習(xí)能力和記憶力形成直接相關(guān)[20]。本研究結(jié)果表明，腦損傷小鼠腦組織中cAMP和p-CREB 蛋白表達(dá)顯著下降，AVP 可抑制cAMP 和p-CREB蛋白表達(dá)下調(diào)，從而修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，抑制腦損傷的作用。

綜上所述，AVP 對氧化應(yīng)激有明顯的抑制作用，對缺血性腦損傷可修復(fù)中樞神經(jīng)、改善記憶力和學(xué)習(xí)能力的作用。表明AVP是一類具有缺血性腦損傷干預(yù)作用的生物活性物質(zhì)，具有一定的開發(fā)利用價值，值得進(jìn)一步深入研究。