繆佩鳳

(東興市人民醫(yī)院，廣西 東興 538051)

0 引言

急性支氣管炎主要由感染或其他非感染因素如過敏、吸煙、空氣污染等所致，臨床表現(xiàn)為咳痰咳痰、發(fā)熱、喘息等，病理表為氣管-支氣管黏膜的急性炎癥反應，為臨床常見的肺系疾病[1,2]。嬰幼兒及老年人易發(fā)病，好發(fā)于冬春季節(jié)，且本病起病急驟、變化快甚至可造成患者死亡，因此及時治療非常必要[1]。

麻杏石甘湯是《傷寒論》中的經(jīng)典方劑，主要由麻黃，杏仁，石膏和甘草四味中藥組成，用于太陽病的治療，后世多用于治療風寒化熱或風熱犯肺，現(xiàn)代臨床上廣泛用于急性支氣管炎的治療[3]。臨床研究表明加用麻杏石甘湯治療急性支氣管炎在炎癥指標恢復時間、退熱時間、咳嗽時間、肺部啰音消失時間及總有效率等方面都優(yōu)于單純的西醫(yī)治療[4,5]。

為探討麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的機制，本文將基于網(wǎng)絡藥理學的技術(shù)，構(gòu)建麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖，利用KEGG分析和GO分析確定其活性通路和活性基因。利用分子對接技術(shù)研究麻杏石甘湯的關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點之間的相互作用，并利用基因注釋驗證上述關(guān)鍵靶點，以期為進一步實驗研究、臨床應用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 化學成分的獲取與活性成分的篩選

從中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)檢索甘草、麻黃、苦杏仁和石膏的成分。根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類 藥 性(drug-likeness，DL)≥0.18初步篩選出活性成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取活性成分相應的蛋白靶點，并刪除不含有靶點的成分。通過STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫將收集到的蛋白靶點轉(zhuǎn)化為對應的基因名稱(gene symbol)，其中物種來源選擇人源性(Homo sapiens)。

1.2 篩選麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的潛在靶點

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，以“acute bronchitis”作為關(guān)鍵詞檢索疾病相關(guān)靶點，獲取急性支氣管炎相關(guān)的疾病靶點。利用在線網(wǎng)站Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)將疾病靶點與“1.1”中獲得的成分靶點取交集，最終獲得麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的候選靶點。

1.3 靶點蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡的構(gòu)建

將1.2中的候選靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“homo sapiens”，置信度設置為0.4，對篩選出的候選靶點進行蛋白互作關(guān)系分析。網(wǎng)絡中節(jié)點(nodes)代表靶蛋白，邊(edges)代表靶蛋白之間的互相作用，度值(degree)代表網(wǎng)絡中節(jié)點與其他節(jié)點的連接數(shù)量，度值越高表示該節(jié)點在網(wǎng)絡中越重要。構(gòu)建PPI網(wǎng)絡后，將文件導入Cytoscape(3.6.0)軟件，并利用Cytohubba插件對網(wǎng)絡進行關(guān)鍵靶點分析，按照degree排名，排名前五位的可認為是麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的關(guān)鍵靶點。

1.4 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡的構(gòu)建

使用Cytoscape構(gòu)建麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，同時采用Cytohubba插件對其進行關(guān)鍵成分分析。按照degree排名，排名前五位的可認為是麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的關(guān)鍵成分。

1.5 生物過程分析

將篩選出的潛在靶點，利用Metascape(http://metascape.org/)數(shù)據(jù)庫，對麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的靶點進行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析與GO生物學過程分析。利用Omicshare(https://www.omicshare.com/)在線繪圖網(wǎng)站繪制KEGG信號通路中排名前20的氣泡圖。

1.6 靶點-信號通路網(wǎng)絡圖的構(gòu)建

利用Cytoscape軟件構(gòu)建KEGG信號通路中排名前20的靶點-通路網(wǎng)絡圖。

1.7 分子對接

利用Autodock4.2.6、AutodockTools1.5.6、pymol2.5和python2.5軟件對1.3得到的關(guān)鍵靶點及1.4得到的關(guān)鍵成分進行半柔性對接。結(jié)合能小于0kJ·mol-1 則表明有自發(fā)結(jié)合的可能。

1.8 關(guān)鍵靶點的基因注釋

利用KEGG(https://www.kegg.jp/)網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫中KEGG Mapper功能，將PPI網(wǎng)絡中degree值排名最高的5個關(guān)鍵靶點在信號通路圖中標注出來，驗證麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的主要信號通路。

2 結(jié)果

2.1 活性成分的篩選結(jié)果

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中找到麻杏石甘湯中4味中藥的成分，并根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18進一步篩選、去重后共得到候選成分123個。將候選成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取其相應的蛋白靶點信息，通過STRING數(shù)據(jù)庫將蛋白靶點轉(zhuǎn)換為基因名稱，剔除重復后共獲得238個潛在基因靶點(表1)。

表1 麻杏石甘湯候選成分的具體信息

2.2 潛在靶點篩選結(jié)果

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中找到急性支氣管炎相關(guān)靶點共1629個，將疾病相關(guān)靶點與麻杏石甘湯的成分靶點分別輸入韋恩圖在線繪制網(wǎng)站(Venny)中，繪制維恩圖，圖1。合并后共得到129個潛在靶點。

圖1 藥物-疾病靶點維恩分析圖

2.3 關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡圖

利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件，對麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的129個潛在靶點進行PPI分析。結(jié)果顯示129個節(jié)點共有2675條邊，degree值排名前五的靶點依次為：AKT1，TP53，IL6，CASP3，VEGFA。這5個靶點可認為是麻杏石甘湯治療AB的關(guān)鍵靶點(圖2)。

圖2 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡圖

2.4 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖構(gòu)建

利用Cytoscape軟件建立藥物-成分-靶點-疾病的可視化網(wǎng)絡圖，見圖3。利用CytoHubba插件分析，按degree值篩選出排名前五的活性成分，依次為槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)、柚皮素(Naringenin)、光甘草定(Glabridin)。網(wǎng)絡圖結(jié)果顯示麻杏石甘湯為多成分、多靶點治療急性支氣管炎的作用機制。

圖3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖

2.5 KEGG通路富集和GO分類富集分析結(jié)果

利用Metascape數(shù)據(jù)庫，以最小計數(shù)為3、P<0.01、富集因子>1.5為篩選條件，對篩選出來的129個潛在靶點(選擇H.sapiens)，進行KEGG通路富集分析和GO分類富集分析。

KEGG通路富集分析共獲得280條通路，對KEGG分析結(jié)果的前20條通路通過Omicshare在線網(wǎng)站進行可視化處理，得到高級氣泡圖。其中氣泡面積大小代表基因數(shù)量，氣泡顏色代表P值的大小，即富集顯著性，見圖4。篩選出的信號通路與疾病相關(guān)的主要有：PI3K/AKT信號通路、IL-17信號通路 、細胞老化、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O信號通路、松弛素信號通路、NF-κB信號通路、JAK-STAT信號通路、程序性壞死、長壽調(diào)節(jié)途徑、鈣信號通路、線粒體和產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡。

圖4 KEGG通路富集分析(上部分氣泡圖，下部分柱狀圖)

GO生物過程功能富集分析共獲得429個條目，見圖5。其中生物過程(biological process)251個，涉及對有毒物質(zhì)的反應、對無機物的反應和凋亡信號通路等；分子功能(molecular function)92個，涉及蛋白激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等；細胞組分(cellular component)86 個，涉及膜筏、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物和轉(zhuǎn)錄因子復合體等。

圖5 GO分析圖(由上至下分別為：GO-BP，GO-CC，GO-MF)

2.6 靶點-信號通路網(wǎng)絡圖的構(gòu)建

為進一步直觀的顯示麻杏石甘湯治療急性支氣管炎涉及KEGG通路及靶點的關(guān)系，使用Cytoscape構(gòu)建了“靶點-信號通路”的網(wǎng)絡圖，見圖6。該通路圖中共有90個節(jié)點，189條邊，平均度值為4.2。KEGG通路中PI3K/AKT信號通路度值最高，為35，其次為IL-17信號通路、細胞老化、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O信號通路等。

圖6 麻杏石甘湯治療AB“靶點-信號通路”網(wǎng)絡圖

2.7 分子對接

利用Autodock對配體和受體進行半柔性對接，結(jié)果顯示quercetin，Kaempferol，Luteolin，Naringenin，Glabridin等5個關(guān)鍵成分與AKT1，TP53，IL-6，CASP3，VEGFA等5個關(guān)鍵靶點之間均有較強的結(jié)合能力。結(jié)合能(binding energy)<-5 kcal·mol-1的 有24對，<-7.0 kcal·mol-1的 有4對，其 中ATK1- Glabridin的結(jié)合能最低，為-8.95 kcal·mol-1，具體對接結(jié)果見表2。

表2 核心成分與核心靶點對接結(jié)果

2.8 關(guān)鍵靶點的基因注釋結(jié)果

利用KEGG數(shù)據(jù)庫的KEGG Mapper功能將5個關(guān)鍵靶點，在PI3K/AKT信號通路中用紅色標注出來，結(jié)果顯示有4個靶點參與PI3K/AKT信號通路的相關(guān)調(diào)控，結(jié)果見圖7。

圖7 麻杏石甘湯調(diào)控急性支氣管炎信號通路靶點(紅色標記)

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法，構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖，表明了麻杏石甘湯多成分、多靶點、多信號通路協(xié)同發(fā)揮作用的特點。其關(guān)鍵成分很可能為槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、光甘草定。藥理作用研究顯示槲皮素，山奈酚具有改善氣道炎癥、抗病毒及防止咳嗽的作用[6-8]。木犀草素對支氣管炎具有解痙的作用[9]。柚皮素為黃烷酮類化合物，具有抗病毒和抗炎的雙重作用[10]。光甘草定為類黃酮化合物，具有多種藥理活性，對于氣道炎癥的藥理活性包括抗氧化作用、抗炎作用及改善呼吸功能等[11]。

麻杏石甘湯活性成分治療急性支氣管炎所調(diào)控的靶點互作網(wǎng)絡表明，關(guān)鍵靶點很可能為AKT1、TP53、IL-6、CASP3、VEGFA。KEGG通路分析和GO分子功能富集分析闡明了麻杏石甘湯多功能、多靶點、多通路治療的機制，相關(guān)的通路有PI3K/AKT信號通路、IL-17信號通路、細胞老化、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O信號通路、松弛素信號通路、NF-κB信號通路、JAKSTAT信號通路、程序性壞死、長壽調(diào)節(jié)途徑、鈣信號通路、線粒體和產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡等。結(jié)合本研究網(wǎng)絡藥理學預測的結(jié)果及相關(guān)文獻回顧，麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的潛在機制可進一步歸納為以下方面。

3.1 抑制細胞增殖

3.1.1 抑制AKT1蛋白激活

研究表明，PI3K/AKT信號通路及下游信號因子在慢性炎癥中炎癥介質(zhì)的表達、活化、炎癥細胞募集、免疫細胞功能、氣道重塑和皮質(zhì)類固醇不敏感中起著至關(guān)重要的作用。來自動物模型，原代細胞和其他疾病臨床研究的數(shù)據(jù)表明，PI3K/AKT抑制劑可作為潛在的治療炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病包括哮喘的新療法[12]。AKT1是PI3K/AKT信號通路重要的游靶標，可參與生長因子、細胞因子等激活下游靶標的細胞信號傳導[13]。AKT1可抑制AKT磷酸化減弱人支氣管平滑肌增殖，以減輕氣道重塑[14]。分子對接結(jié)果顯示AKT1蛋白與槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、光甘草定的結(jié)合能均小于-5.0 kcal·mol-1，提示AKT1很可能為這五個關(guān)鍵活性成分的靶標之一。槲皮素、木犀草素、柚皮素均有研究表明可抑制PI3K激活而發(fā)揮抑制支氣管炎癥、減輕氣道重塑的作用[15-17]。據(jù)此，槲皮素、木犀草和柚皮素與AKT1蛋白結(jié)合，抑制支氣管炎癥、減少氣道重塑很有可能是麻杏石甘湯治療急性支氣管炎的機制之一。

3.1.2 抑制IL-6生成

IL-6是炎癥反應的重要因子之一，有研究表明IL-6在人體中參與了多種炎癥性疾病的發(fā)生，屬于一種促炎因子[18]。有研究表明，槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素和光甘草定在IL-17信號通路，抑制IL-6的生成、改善上呼吸道感染癥狀有積極的意義[19,20]。

3.2 調(diào)節(jié)鈣信號通道

氣道平滑肌的收縮力增強需要細胞內(nèi)鈣濃度升高，在靜息狀態(tài)下，氣道平滑肌細胞維持相對較低的細胞內(nèi)鈣濃度，并通過激動劑對表面受體的激活致使細胞內(nèi)鈣濃度升高，最終導致細胞收縮。促炎因子參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)途徑的表達與活性，從而導致氣道平滑肌細胞高反應性[21]。有研究表明槲皮素、柚皮素及光甘草定均可抑制細胞因子產(chǎn)生，激活大電導的Ca2+活化的K+通道來松弛氣管平滑肌，介導質(zhì)膜超極化并減少Ca2+流入[22-24]。

3.3 調(diào)節(jié)線粒體功能

線粒體在Ca2+調(diào)節(jié)、氧化還原調(diào)節(jié)和細胞生物學方面具有多種多樣但相互聯(lián)系的作用，對于氣道平滑肌的生理變化也起到至關(guān)重要的作用。越來越多的研究表明線粒體功能障礙與氣道疾病密切相關(guān)[25]。槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素和光甘草定均有文獻報道能夠調(diào)節(jié)線粒體功能，保護相關(guān)的細胞免受氧化應激[26-29]。

急性支氣管炎是由感染、物理、化學刺激或過敏等因素引起的急性氣管-支氣管黏膜炎癥，常發(fā)生于寒冷季節(jié)或氣溫突然變冷時，藥物治療的原則主要為鎮(zhèn)咳、祛痰、解痙抗過敏和抗感染治療[30]。麻杏石甘湯作為《傷寒論》中的經(jīng)典方劑，對咳嗽、支氣管炎、肺炎等多種肺部疾病均有良好的治療效果，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、解熱、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，“清”“ 透”結(jié)合，宣肺清熱[3,31]。本研究初步表明麻杏石甘湯治療急性支氣管炎為多成分、多靶點和多通路的的模式。其潛在的機制為抑制細胞增殖，調(diào)節(jié)鈣信號通道和調(diào)節(jié)線粒體功能。但尚有部分通路和機制未得到驗證，本研究可以為之后進一步的研究提供思路和科學依據(jù)。但由于網(wǎng)絡藥理學和互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)有一定的局限性，不能完全表達中醫(yī)藥復方的有效成分及其相關(guān)作用機制，由此結(jié)合網(wǎng)絡藥理學的分析結(jié)果仍需后續(xù)體內(nèi)外試驗的觀察與驗證[32]。