袁翠平，馬宇毅，張 碧，何競(jìng)銘，李 軍

（廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 530001）

自20世紀(jì)以來，人們?cè)趧?dòng)物的飼料中添加抗生素，來預(yù)防機(jī)體感染疾病，促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體的快速生長(zhǎng)，提高飼料的利用率[1]。由于過度使用抗生素從而導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生，致使動(dòng)物機(jī)體免疫力水平下降，造成畜產(chǎn)品藥物殘留，危害人類健康，污染生態(tài)環(huán)境[2]。人們開始對(duì)綠色安全、無殘留，可以有效替代抗生素使用的新型飼料添加劑重視[3]。隨著抗生素替代品的不斷開發(fā)和益生菌制劑的深入研究，獲得性能優(yōu)良的菌株十分重要。

乳酸菌是動(dòng)物腸道中的正常微生物，在微生態(tài)制品當(dāng)中的地位舉足輕重，具有調(diào)節(jié)腸道環(huán)境，維持腸道內(nèi)菌群平衡，為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，抑制腐敗菌的繁殖，清楚腐敗菌產(chǎn)生的垃圾，促進(jìn)蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高免疫能力，保護(hù)動(dòng)物機(jī)體健康的作用[4]，因此，乳酸菌制劑相關(guān)的研究具有十分重要意義。菌種的安全是乳酸菌制劑作為后續(xù)開發(fā)的前提。本研究從豬糞便內(nèi)分離出一株乳酸菌，并對(duì)乳酸菌耐受性、耐藥性、安全性等方面進(jìn)行檢測(cè)，為研制豬用益生菌制劑提供良好的材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品

選用購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的昆明小鼠，體重約20g。

試驗(yàn)樣品來自廣西某養(yǎng)殖場(chǎng)健康豬群的新鮮糞便。

1.2 主要試劑及儀器

LB瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，革蘭氏染色液、藥敏紙片、生化鑒定試劑購(gòu)自杭州濱河微生物制劑品有限公司，生理鹽水本實(shí)驗(yàn)室自制，注射器購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，電子天平購(gòu)自于satorius公司。

2 方法

2.1 樣品采集

取新鮮糞便約10g，置于無菌的三角燒瓶中，加入20 mL無菌MRS液體培養(yǎng)基均勻混和，1000 r/min離心10 min后，取上清液進(jìn)行細(xì)菌分離。

2.2 細(xì)菌的分離鑒定

將上清液在超凈工作臺(tái)內(nèi)按照10倍連續(xù)稀釋，取各稀釋度分別劃線接種MRS培養(yǎng)皿上，37℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑取單個(gè)菌落，分別接種LB及MRS培養(yǎng)皿進(jìn)行純化培養(yǎng)，24 h后觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

2.3 生理生化鑒定

將純化好的菌種參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化鑒定。

2.4 乳酸菌的生物學(xué)研究

2.4.1 耐酸性試驗(yàn)

將分離菌（接種后分離菌濃度約為1×106CFU/mL）分別接種于pH值為2～8的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，測(cè)定其OD600nm值。

2.4.2 耐膽鹽性試驗(yàn)

將分離菌（接種后分離菌濃度約為1×106CFU/mL）分別接種于含牛膽鹽0.10%、0.20%、0.30%、0.40%的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，測(cè)定其OD600nm值。

2.4.3 耐熱性能試驗(yàn)

將分離菌接種于MRS液體培養(yǎng)基活化（活化后分離菌濃度約為2×108CFU/mL）后，分別置于37℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃共計(jì)6個(gè)溫度梯度，在水中放置1h后，按照1∶200的比例分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，測(cè)定其OD600nm值。

2.5 16S rDNA測(cè)序鑒定

將純化的菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增后送蘇州金唯智生物有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。

2.6 耐藥性試驗(yàn)

采用NCCLS推薦的K-B紙片法，將純化的菌株進(jìn)行磷霉素、阿米卡星、大觀霉素、鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素等24種藥物做敏感性試驗(yàn)。

2.7 小鼠致病性試驗(yàn)

選用健康昆明小鼠30只，隨機(jī)分為兩組，分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組分為常規(guī)劑量組和高劑量組，常規(guī)劑量組按106CFU/mL灌胃，高劑量組按108CFU/mL灌胃，對(duì)照組灌入等量的生理鹽水。一天一次，連續(xù)2周，觀察記錄小鼠的臨床表現(xiàn)情況。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)特征及染色結(jié)果

純化后的菌落為圓形，乳白色，表面光滑濕潤(rùn)有光澤、邊緣整齊不透明邊、凸起，容易挑起。通過革蘭氏染色鏡檢可見，單個(gè)、成對(duì)或者成排的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，無芽孢及鞭毛。符合乳酸菌的形態(tài)特征。

3.2 生理生化鑒定結(jié)果

按照《乳酸細(xì)菌的分類鑒定與實(shí)驗(yàn)方法》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)分離菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)，初步判斷為乳酸桿菌，命名為G202005。

表1 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

3.3 16S rDNA測(cè)序

經(jīng)測(cè)序鑒定，與NCBI公布的唾液乳桿菌的同源性為97.6%，進(jìn)一步證實(shí)分離的菌株為乳酸桿菌。

3.4 乳酸菌的生物學(xué)研究

菌株G202005在pH值2～8時(shí)均能生長(zhǎng)，最適宜的pH值為5～7，表明菌株G202005有較強(qiáng)的耐酸能力。隨著膽鹽濃度的增加至0.40%，OD600nm值逐漸降低，但仍有細(xì)菌生長(zhǎng)，說明菌株G202005有較強(qiáng)的耐膽堿能力。經(jīng)70℃處理后，仍檢出有細(xì)菌生存，說明菌株G202005有較強(qiáng)的耐熱能力。

3.5 乳酸菌的耐藥性測(cè)定

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株G202005對(duì)四環(huán)素、多粘菌素甲氧嘧啶、復(fù)方新諾明、磺胺異亞唑、羅紅霉素6種藥物產(chǎn)生耐藥性（表2）。

表2 耐藥性試驗(yàn)結(jié)果

3.6 小鼠致病性試驗(yàn)

兩組小鼠連續(xù)口服2周，健康狀況良好，行為、生長(zhǎng)、采食量和病理組織剖檢均無明顯異常，說明這株分離菌株對(duì)小鼠無毒害作用，安全的。

4 討論

近年來，為了改善腸道內(nèi)環(huán)境，豐富豬群胃腸道的菌群種類，提高豬群的生產(chǎn)性能，大力開發(fā)優(yōu)質(zhì)益生菌制劑。理想的益生菌菌株應(yīng)該來自同源動(dòng)物胃腸道中，從動(dòng)物糞便中分離的菌株經(jīng)過胃腸道的篩選，具有較強(qiáng)的耐受能力[5]。乳酸菌通常為分解植物和奶制品中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌，是國(guó)際公認(rèn)的食品級(jí)安全微生物（GRAS），對(duì)人類、以及動(dòng)植物的健康都有益[6]?？梢哉{(diào)節(jié)畜禽腸道菌群結(jié)構(gòu)，維持腸道菌群平衡。乳酸菌進(jìn)入動(dòng)物胃腸道后可以分泌產(chǎn)生多種酶和微量元素，促進(jìn)畜禽對(duì)飼料的消化吸收，促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育[7]。乳酸菌也是免疫激活劑，可以刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，使體液免疫和細(xì)胞免疫同時(shí)發(fā)揮作用，并且也可以提高免疫球蛋白在腸壁免疫細(xì)胞分泌的水平，從而提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力，保護(hù)機(jī)體健康[8]。乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)通常包括細(xì)菌素、有機(jī)酸、蛋白多肽類等，這些物質(zhì)可以致使有害菌病菌裂解死亡，也可協(xié)同其他抑菌物質(zhì)將病原菌殺滅，或者降低環(huán)境的pH從而抑制腸道有害菌的生長(zhǎng)[9]。

本試驗(yàn)對(duì)健康豬群糞便中分離菌株形態(tài)學(xué)特性、生理生化、16S rDNA測(cè)序鑒定，通過藥敏試驗(yàn)、小鼠致病性試驗(yàn)以及安全性評(píng)價(jià)，篩選出一株具有優(yōu)良特性的乳酸菌，該菌具有耐熱、耐酸、耐膽堿、安全無毒的特點(diǎn)，在豬飼料益生菌添加劑方面有潛在的應(yīng)用前景。