陳奕帆，賀奕森，唐濤，王真，單春會，趙山山，郝光飛*

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲056038；2.石河子大學(xué)，新疆石河子832003）

近年來，乳酸菌作為一種具有保健功能的優(yōu)質(zhì)天然抗氧化劑備受關(guān)注。有研究表明，乳酸菌可控制腸道微生態(tài)平衡，并有較好的抗氧化性和疏水性，能夠提高糖苷型大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化率[1]，較高的抗氧化活性具有預(yù)防和治療氧化損傷、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化物的形成等重要生理功能[2]，因此在發(fā)酵制品中廣泛應(yīng)用。而乳酸菌發(fā)酵制品中，發(fā)酵飲料是功能性食品研究熱點，乳酸菌作為發(fā)酵飲料的關(guān)鍵因素之一，不僅能改善發(fā)酵飲料的營養(yǎng)、風(fēng)味，一些功能獨特的乳酸菌還可用于提高發(fā)酵飲料功能性，如副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）YJ1使發(fā)酵樹莓汁中總黃酮和總酚含量分別增加了23.00%、18.58%，DPPH自由基和羥基自由基清除能力分別提高了22.92%、15.63%[3]；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）發(fā)酵的黃瓜牛奶復(fù)合物其羥基自由基清除率達(dá)87%，DPPH自由基清除率達(dá)85.12%[4]。

紅棗原產(chǎn)于中國并廣泛栽培，其含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，具有極高的食用價值和藥用價值，在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中具有補(bǔ)氣、養(yǎng)生、安神等功能[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)紅棗中的多糖、多酚和三萜類化合物具有延緩衰老、提高人體免疫力等多種生理功效[6]，并含有多種對超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH自由基清除效果優(yōu)良的抗氧化性物質(zhì)[7]。豐富的功能性使紅棗開發(fā)與利用熱度持續(xù)升高，其中發(fā)酵紅棗制品逐漸受到廣大消費者的青睞，但發(fā)酵過程中出現(xiàn)發(fā)酵能力較差、發(fā)酵后抗氧化性降低等問題使其品質(zhì)及產(chǎn)量受到限制，有必要進(jìn)一步開發(fā)能夠穩(wěn)定提升品質(zhì)及抗氧化活性的發(fā)酵劑，乳酸菌發(fā)酵能夠提高飲料的抗氧化活性、改善果汁風(fēng)味、提高口感及品質(zhì)，且具有多種益生功能[8]；另外，乳酸菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生抗壞血酸等新的抗氧化活性物質(zhì)，同時提高羥基自由基和DPPH自由基的清除能力[9]。將紅棗汁與乳酸菌結(jié)合發(fā)酵，以期能夠穩(wěn)定提升紅棗發(fā)酵汁的品質(zhì)及抗氧化活性。

因此，本研究擬從紅棗表面和泡菜中分離出乳酸菌，從產(chǎn)酸、抗氧化活性、發(fā)酵能力3個方面篩選出能夠提升發(fā)酵紅棗汁抗氧化活性、改善其風(fēng)味品質(zhì)的乳酸菌，豐富發(fā)酵紅棗汁專用菌種資源，解決缺少紅棗汁發(fā)酵專用菌株及紅棗加工產(chǎn)品單一的問題，為乳酸菌發(fā)酵紅棗汁的生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

泡菜：河北、云南、四川地區(qū)的自然發(fā)酵泡菜；紅棗：采自新疆和田地區(qū)、河北省滄州地區(qū)。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；接觸酶試驗培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基、H2S產(chǎn)生試驗培養(yǎng)基：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；糖發(fā)酵培養(yǎng)基：上海晶純試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHPW-70臺式振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Microfuge 20高速離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；UV-1901紫外可見分光光度計：杭州艾普儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；T100 Thermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀、Power pac2000電泳儀、Universal Hood II凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；2，2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid）diammoniumsalt，ABTS]法總抗氧化能力檢測試劑盒、鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法總抗氧化能力檢測試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所。

2 方法

2.1 乳酸菌的分離純化

2.1.1 紅棗樣品中乳酸菌的分離純化

按照參考文獻(xiàn)[10-11]的方法略加修改，將紅棗樣品浸泡在無菌生理鹽水中，37℃、170 r/min條件下培養(yǎng)30 min，經(jīng)梯度稀釋后每個梯度取200 μL菌液澆注于CaCO3-MRS瓊脂培養(yǎng)基（含1.5%碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基）中，37℃下倒置培養(yǎng)48 h。挑取溶鈣圈直徑較大、菌落圓形突起且邊緣光滑的單菌落轉(zhuǎn)接到MRS平板上劃線，純化培養(yǎng)3次，將單菌落轉(zhuǎn)接至MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后，保種及備用。

2.1.2 泡菜樣品中乳酸菌的分離純化

按照參考文獻(xiàn)[10]中的方法對泡菜中乳酸菌進(jìn)行分離。

2.2 高產(chǎn)酸菌株篩選

按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[12]中的方法，測定菌株產(chǎn)酸能力。

2.3 生理生化試驗

將分離純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗，篩選出革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株進(jìn)行硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗和糖發(fā)酵試驗，試驗結(jié)果對照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（第八版）[13]、《乳酸菌細(xì)菌的分類鑒定及實驗方法》[14]進(jìn)行的綜合判定。

2.4 基因序列檢測及其系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

按照DNA提取試劑盒說明方法提取的菌株DNA為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系（25 μL）：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）混合物 12.5μL，DNA 模板 1 μL，正向引物（5'-AACTGAGTTTGATCCTGGCTC-3'）、反向引物（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）各 1 μL，無酶水 9.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，42℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行測序，經(jīng)同源序列比對分析，采用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

2.5 抗氧化活性測定

2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定按照參考文獻(xiàn)[16]中方法測定DPPH自由基清除率。

2.5.2 羥基自由基清除能力的測定按照參考文獻(xiàn)[17]中方法測定羥基自由基清除率。

2.5.3 ABTS+自由基清除率測定ABTS+自由基清除率按照試劑盒操作要求測定。

2.5.4 FRAP法測定總抗氧化能力FRAP值按照試劑盒操作要求測定。

2.6 優(yōu)良菌株發(fā)酵能力的測定

將高產(chǎn)酸、高抗氧化活性的乳酸菌活化后，5 000 r/min離心2 min，無菌生理鹽水清洗菌體，以5%的接種量、菌體濃度為1×108cfu/mL接種于經(jīng)過去核、破碎、以 1∶6（g/mL）料液比打漿處理的紅棗汁中[18]，37 ℃發(fā)酵72 h后以酸堿滴定法[19]測定酸度并進(jìn)行感官評價[20]，每組試驗3個平行，選擇綜合效果最優(yōu)的作為紅棗汁發(fā)酵菌株。

2.7 感官評定

由10名專業(yè)人員組成評定小組從色澤、香氣、口感、組織狀態(tài)4個方面對紅棗汁的感官質(zhì)量進(jìn)行評價，每項滿分為9分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評定評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory assessment

3 結(jié)果與分析

3.1 高產(chǎn)酸菌株的分離篩選

從樣品中分離出176株產(chǎn)酸細(xì)菌，挑選溶鈣圈直徑較大、菌落圓形突起、乳白色、濕潤且表面光滑的10株菌株（泡菜分離菌株以ZC命名，紅棗表面分離菌株以PC命名）進(jìn)行產(chǎn)酸試驗，產(chǎn)酸量見表2。

表2 高產(chǎn)酸菌株的篩選結(jié)果Table 2 Screening results of high acid-producing strains

由表 2 可知，ZC2、ZC4、PC9、PC11 的產(chǎn)酸量顯著高于其它菌株（P＜0.05），確定為高產(chǎn)酸菌株。

3.2 形態(tài)鑒定及生理生化試驗結(jié)果

10株產(chǎn)酸菌株均為革蘭氏陽性（G+）、無芽孢、過氧化氫酶陰性的短桿狀菌株，生化試驗表明，10株菌株滿足乳酸菌無運動性、不產(chǎn)生氣體、不液化明膠、不還原硝酸鹽、不產(chǎn)生吲哚及H2S，可以發(fā)酵蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、核糖、纖維二糖、棉籽糖、海藻糖、木糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、七葉靈、苦杏仁苷和水楊苷的特性，初步鑒定這10株菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

3.3 基因序列檢測及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

乳酸菌的形態(tài)學(xué)鑒定只能初步判斷表型特征相似，并不代表基因型親緣關(guān)系相近，基因型特征需進(jìn)一步鑒定。經(jīng)同源性比對后系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果見圖1。

圖1 基于16S rDNA基因的10株菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 10 strains based on 16S rDNA gene

菌株 ZC1、ZC2、ZC4、ZC5、PC8、PC9 與 Lactobacillus plantarum KGP_PME_01-07的同源性分別為99.34%、99.62%、99.76%、99.89%、99.93%、99.73%，菌株 ZC3、PC11、PC12、PC14 與 Lactobacillus plantarum HBUAS52372 的同源性分別為99.36%、100%、99.57%、99.34%，因此將這10株菌株鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

3.4 抗氧化活性

DPPH自由基及羥基自由基清除率是評價抗氧化性能的重要指標(biāo)，在一定程度上反映菌株的抗氧化能力[21]，乳酸菌不同菌株之間的抗氧化活性具有較大差異。圖2為不同乳酸菌發(fā)酵紅棗汁對DPPH自由基及羥基自由基的清除能力。

圖2 不同菌株發(fā)酵紅棗汁抗氧化能力的比較Fig.2 Comparison of antioxidant activity in red date juice fermented by different strains

由圖2可知，10株乳酸菌發(fā)酵紅棗汁對DPPH自由基清除能力較強(qiáng)的菌株依次為ZC2＞PC9＞PC11＞PC14，其清除能力分別達(dá)到90.62%、87.82%、86.32%和74.91%；10株乳酸菌發(fā)酵紅棗汁對羥基自由基清除能力不同，其中清除能力最強(qiáng)的菌株為PC9，其次是菌株P(guān)C11、ZC2和ZC4，清除率分別為 67.85%、63.78%、62.48%和59.48%。綜合分析DPPH自由基及羥基自由基清除能力發(fā)現(xiàn)，菌株 ZC2、ZC4、PC9、PC11 發(fā)酵的紅棗汁清除DPPH自由基和羥基自由基的能力均比較強(qiáng)。

3.5 優(yōu)良菌株發(fā)酵能力測定

將高產(chǎn)酸、高抗氧化活性的4株優(yōu)良菌株接種于紅棗汁中，發(fā)酵結(jié)果見圖3，感官評價結(jié)果見表3。

圖3 不同菌株對發(fā)酵紅棗汁酸度的影響Fig.3 Effects of different strains on acidity of fermented red date juice

表3 不同菌株發(fā)酵的紅棗汁感官評分結(jié)果Table 3 Sensory scoring results of red date juice fermented by different strains

由圖3可知，4株乳酸菌發(fā)酵過程中0～12 h發(fā)酵速率緩慢；12 h～60 h發(fā)酵速率提升較快，酸度上升明顯；60 h～72 h整體酸度提高，但過高的酸度會不同程度上抑制發(fā)酵，發(fā)酵速率趨于平緩，酸度緩慢增高，其中菌株ZC4、PC9發(fā)酵的紅棗汁酸度提升速率較快，相比于ZC2、PC11能更快增大發(fā)酵體系的酸度。

結(jié)合表3可知，紅棗表面分離菌株整體感官評分優(yōu)于泡菜分離菌株，其中菌株ZC4發(fā)酵的紅棗汁過高的酸度影響紅棗汁的口感及風(fēng)味，菌株ZC2發(fā)酵后的紅棗汁酸度過低，導(dǎo)致發(fā)酵香味與紅棗香味不協(xié)調(diào)。菌株P(guān)C9發(fā)酵的紅棗汁酸甜可口、組織細(xì)膩，具有紅棗的香氣，菌株P(guān)C11與PC9相比發(fā)酵不充分導(dǎo)致口感評分較差，且PC9發(fā)酵速率大于PC11。結(jié)合發(fā)酵紅棗汁的產(chǎn)酸量與感官評分結(jié)果，PC9具有作為發(fā)酵紅棗汁專用菌株的潛力。

3.6 發(fā)酵前后紅棗汁抗氧化活性變化

將菌株P(guān)C9以5%接種量（菌體濃度為1×108cfu/mL）接入紅棗汁中37℃發(fā)酵72 h，測定發(fā)酵紅棗汁的抗氧化活性，結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵紅棗汁的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of fermented red date juice

與未發(fā)酵的紅棗汁相比，DPPH自由基、羥基自由基的清除率顯著增加，其DPPH自由基清除率提升了21.52%，羥基自由基清除率提升了15.19%。發(fā)酵后紅棗汁ABTS+自由基清除率提高了23.73%；FRAP提高了19.37%。

4 結(jié)論與討論

本研究以新疆和田地區(qū)、河北省滄州地區(qū)的紅棗以及河北、云南、四川地區(qū)的自然發(fā)酵泡菜為樣品分離出對DPPH自由基及羥基自由基都有不同程度清除能力的10株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），并篩選出高產(chǎn)酸、高抗氧化活性的4株植物乳桿菌ZC2、ZC4、PC9、PC11應(yīng)用于紅棗汁的發(fā)酵，結(jié)合發(fā)酵紅棗汁的酸度及感官評價結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅棗表面分離菌株P(guān)C9的發(fā)酵效果最佳。有研究表明，在番茄中分離的乳酸菌與同屬外來菌株同時發(fā)酵番茄，番茄分離菌株發(fā)酵飲料有更高抗壞血酸、谷胱甘肽和總抗氧化活性[22]；菠蘿中篩選出的乳酸菌應(yīng)用于菠蘿發(fā)酵后與同屬外來菌株相比抗氧化活性最高，色澤保存及香氣更好[22]，這表明紅棗表面分離的菌株具有更高的抗氧化活性，且與未發(fā)酵紅棗汁相比，發(fā)酵紅棗汁DPPH自由基和羥基自由基清除能力分別提高了21.52%、15.19%，ABTS+自由基清除率和FRAP分別增加了23.73%、19.37%，并能顯著提高紅棗汁風(fēng)味口感。因此紅棗表面分離菌株具有作為發(fā)酵紅棗汁專用菌株的潛在優(yōu)勢，一方面可以顯著提高食品DPPH自由基、羥基自由基清除率，另一方面還可以提升發(fā)酵食品風(fēng)味及營養(yǎng)，為紅棗表面分離乳酸菌的研究提供了一定的理論依據(jù)，可作為新的研究方向進(jìn)一步開發(fā)。