孫永杰，方小磊，張興華，胡楠楠，尤麗新

（長(zhǎng)春科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130600）

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）發(fā)源于安第斯山區(qū)，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食物。藜麥中黃酮類物質(zhì)特別豐富，其中主要包括黃酮醇、槲皮素、山奈酚等[1]。由于其黃酮類物質(zhì)含量的豐富性，越來越多的研究人員開始對(duì)其提取過程、工藝優(yōu)化及其產(chǎn)品應(yīng)用展開一系列研究。如張永花[2]以引種的山西藜麥為研究對(duì)象，對(duì)黎麥種子總黃酮進(jìn)行了提取。但現(xiàn)有研究普遍存在黃酮類物質(zhì)得率不高的問題。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）產(chǎn)生的毒性劇烈，對(duì)食品行業(yè)造成巨大威脅[3]。面對(duì)這樣的現(xiàn)狀，許多的研究人員開始轉(zhuǎn)向?qū)瘘S色葡萄球菌天然抑菌劑的研究，陳國(guó)妮[4]在對(duì)馬齒莧黃酮類化合物抑菌機(jī)理研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物以促使細(xì)菌細(xì)胞膜裂解的方式，使細(xì)菌失去活性，產(chǎn)生抑菌效果。譚才鄧等[5]對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌試驗(yàn)的抑菌圈法進(jìn)行比較研究時(shí)得出，通過對(duì)紙片法、打孔法、牛津杯法等定性試驗(yàn)方法進(jìn)行比較，打孔法所得到的抑菌圈在清晰程度、重復(fù)性等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，應(yīng)該作為定性試驗(yàn)的優(yōu)先選擇方案。

本試驗(yàn)旨在改進(jìn)藜麥黃酮類物質(zhì)提取工藝的條件及參數(shù)以達(dá)到更高的黃酮類物質(zhì)得率，并研究其提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果，以期為藜麥黃酮類物質(zhì)的得率提升、天然活性抑菌劑的開發(fā)提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金黃色葡萄球菌ATCC6538（Staphylococcus aureus）：招遠(yuǎn)拓普生物工程有限公司。藜麥：吉林省通榆市藜麥種植基地。

無水乙醇：無錫東能化工科技有限公司；氫氧化鈉：滄州峰林化工產(chǎn)品有限公司；亞硝酸鈉：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：上海金穗生物科技有限公司；蛋白胨：天津市龍騰化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉：濰坊玉鼎化工有限公司；氯化鉀、磷酸二氫鉀：上海華正化學(xué)試劑廠；瓊脂、磷酸二氫鉀：武漢豐竹林化學(xué)科技有限公司；磷酸二氫鉀：濰坊市晨陽化工有限公司；硝酸鉀：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉粉：天津市華東試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

DGG-914OA電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：鄭州辰星儀器設(shè)備有限公司；DFY-1000C高速粉碎機(jī)：大德藥機(jī)有限公司；SKY2103-1高速氣流粉碎機(jī)：上海人和科學(xué)儀器有限公司；LANYI-650E超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：上海蘭儀實(shí)業(yè)有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見光分光光度計(jì)：山東晨拓科學(xué)儀器有限公司；PHS-25精密數(shù)顯酸度計(jì)：上海雙旭電子有限公司；SPX-400生化培養(yǎng)箱：山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藜麥黃酮類物質(zhì)的提取

1.3.1.1 藜麥種子預(yù)處理

用電子天平稱取若干份的藜麥種子各150g，在電熱鼓風(fēng)干燥箱65℃的溫度條件下進(jìn)行脫水干燥，期間多次觀察檢查，以確保脫水程度。干燥完成之后，置于常溫干燥箱中。待其溫度下降之后，用高速粉碎機(jī)將烘干的藜麥種子進(jìn)行粉碎，控制粉碎程度。過80目篩，再進(jìn)行高速氣流粉碎[6-7]。將粉末按照編號(hào)組別收集完全，確保每組100g的粉末量，完成后立即放進(jìn)硅膠干燥室備用。

1.3.1.2 超聲波輔助提取與分離

將干燥室的藜麥粉末取出，用78%乙醇溶液，按1∶52（g/mL）的料液比，對(duì)粉末進(jìn)行浸泡。將混懸液連同燒杯放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，在230 W的功率條件下提取28 min。達(dá)標(biāo)之后，打開抽氣泵裝置，將混懸液緩緩倒入進(jìn)行分離，視分離出液體的澄清度適當(dāng)調(diào)整分離次數(shù)，最終得到澄清的藜麥黃酮類物質(zhì)提取液，在510 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以料液比、超聲波功率、乙醇濃度、超聲波浸提時(shí)間作為主要影響因素，對(duì)各個(gè)因素選取5個(gè)不同水平[料液比 1∶44、1∶48、1∶52、1∶56、1∶60（g/mL），超聲波功率 200、215、230、245、260 W，乙醇濃度 70%、74%、78%、82%、86%，超聲波浸提時(shí)間 20、24、28、32、36 min]進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以藜麥黃酮類物質(zhì)的得率作為參考指標(biāo)，對(duì)料液比、超聲波功率、乙醇濃度、超聲波浸提時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行考察，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以確定其最佳的工藝條件。因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)水平Table 1 Orthogonal test leve

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線繪制

準(zhǔn)備已清洗干燥的30 mL試管6支，分別對(duì)6支試管進(jìn)行編號(hào)，按順序在各支試管中加入0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，再分別加78%的乙醇溶液至10 mL。在各支試管中分別加入等量的5%亞硝酸溶液0.6 mL，等待6 min，再分別加入0.6 mL的10%硝酸鋁溶液，靜置6 min，加入1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液8 mL，立即混勻，最后在各試管中加入78%的乙醇溶液0.8 mL，靜置15 min，在510 nm的波長(zhǎng)條件下，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線[8]。根據(jù)下面公式測(cè)定藜麥黃酮類物質(zhì)得率。

式中：C為樣液濃度，μg/mL；V0為樣液定容后的體積，mL；V1為測(cè)定吸光度用樣液的體積，mL；V2為測(cè)定時(shí)稀釋體積，mL；W為稱取樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 抑菌試驗(yàn)

1.3.5.1 菌種活化

在凈化工作臺(tái)無菌條件下，打開金黃色葡萄球菌凍干菌種管，加入10mL在高壓蒸汽滅菌鍋121℃、20min條件下滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯，用滅菌吸管反復(fù)吹打，使其分散均勻。用移液槍從中吸取10 μL，加入另一支5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管并混勻，37℃培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用接種環(huán)取少量劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，在37℃培養(yǎng)18 h。用接種環(huán)挑取平板上生長(zhǎng)良好的典型菌落，劃線于另一支營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，37℃培養(yǎng)18 h后，得到其三代培養(yǎng)物。

1.3.5.2 菌液制備

選擇培養(yǎng)后菌落生長(zhǎng)形態(tài)良好的金黃色葡萄球菌第三代培養(yǎng)物斜面，在凈化工作臺(tái)無菌條件下，用10 mL的移液槍加入配制好的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）5 mL，浸沒斜面以上，用接種環(huán)將斜面的金黃色葡萄球菌菌苔刮下，充分振蕩。用滅菌吸管將混懸液吸出，移入另一只滅菌潔凈試管，用電動(dòng)混合器混合均勻。將初步制成的菌懸液比照0.5麥?zhǔn)蠞岫?，用PBS緩沖液進(jìn)行10倍梯度稀釋，以保證菌濃度在1×106cfu/mL左右。

1.3.5.3 藜麥黃酮提取液的準(zhǔn)備

將初步提取得到的藜麥黃酮提取液通過60℃減壓濃縮方式，分別濃縮 480、32、38、44 mg/100 mL 4組不同濃度，前一組用于微量二倍稀釋法測(cè)最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值，后3組作為打孔法抑菌圈測(cè)定的3組不同濃度的提取液。濃縮完成后，分組收集于不同的三角瓶中，每組標(biāo)上編號(hào)，用封口膜封口，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.4 打孔法測(cè)量抑菌圈直徑

將高壓滅菌的培養(yǎng)基移入60℃水浴鍋中冷卻，擦拭酒精棉，移入超凈臺(tái)。平板中加入100 μL濃度為1×106cfu/mL的菌液，各加入15 mL左右的培養(yǎng)基，輕微振蕩平板，以保證培養(yǎng)基與菌液充分混合，使金黃色葡萄球菌均勻地分散在培養(yǎng)基中?；靹蚝?，使其自然冷卻凝固，待其凝固完全后備用。用100 μL槍頭在平板中垂直打孔，每板打孔3個(gè)，分為1組。打完孔后，向每孔注入0.5 mL準(zhǔn)備好的藜麥黃酮提取液[9-10]。同時(shí)設(shè)置一組未加藜麥黃酮提取液的平板作為陽性對(duì)照組，37℃培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)完成后，觀察抑菌圈，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其抑菌圈的直徑并記錄。

1.3.5.5 微量二倍稀釋法

在超凈臺(tái)無菌條件下，用移液槍在96孔板前5排均加入100 μL的肉湯，吸取制備好的藜麥黃酮提取液100μL加入第一排第一孔，再從中吸出一半加入第二孔，進(jìn)行二倍稀釋，依次由前一孔移出100μL到后一孔，最后一孔吸出100μL舍去，即每孔對(duì)應(yīng)的藜麥黃酮提取液濃度分別為 240.000、120.000、60.000、30.000、15.000、7.500、3.750、1.875、0.938、0.469、0.234、0.117 mg/100 mL，最后分別加入1×106cfu/mL濃度的菌液10 μL，重復(fù)兩排，所有操作同上。設(shè)第4排為陰性對(duì)照組，即除無菌液加入之外其他余操作同上，設(shè)第5排為陽性對(duì)照組，操作同上，第12列為每排的空白對(duì)照。于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)出各孔初始吸光度，全部完成之后，37℃條件下培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)結(jié)束后，以同樣的方式測(cè)出600 nm波長(zhǎng)下各孔吸光度，前后的吸光度差值作為判定標(biāo)準(zhǔn)，ΔA＞0.2視作有菌生長(zhǎng)，最小無菌生長(zhǎng)孔對(duì)應(yīng)的藜麥黃酮提取液濃度則為其對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度即MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線Fig.1 Standard rutin curve

由圖1可得，y=0.125 1x－0.126的擬合公式，其擬合系數(shù)R2已達(dá)到0.999 9，說明繪制而成的標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線具有較高的線性相關(guān)性。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)藜麥黃酮類物質(zhì)得率的影響

料液比對(duì)藜麥黃酮類物質(zhì)得率的影響見圖2。

圖2 料液比對(duì)藜麥黃酮類物質(zhì)得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of quinoa flavonoids

由圖2可知，黃酮類物質(zhì)得率和料液比呈現(xiàn)出正向關(guān)系，而在料液比到達(dá)1∶52（g/mL）之后，正向關(guān)系不再顯著，即使料液比中提取液的比例再增加，其對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的提升作用并不明顯。這可能是因?yàn)?，試?yàn)選擇的提取液為乙醇溶液，當(dāng)藜麥黃酮類物質(zhì)在提取液中的擴(kuò)散達(dá)到平衡時(shí)，再增加提取液的加入量也無法對(duì)黃酮類物質(zhì)的溶出產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用。因此基于經(jīng)濟(jì)節(jié)約的選擇，最終選擇料液比1∶52（g/mL）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.2 超聲波功率對(duì)藜麥黃酮類物質(zhì)得率的影響

超聲波功率對(duì)藜麥黃酮類物質(zhì)得率的影響見圖3。

圖3 超聲波功率對(duì)藜麥黃酮類物質(zhì)得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of quinoa flavonoids

由圖3可知，功率從200 W到230 W的變化階段，黃酮類物質(zhì)得率明顯升高，但功率到達(dá)230 W之后，黃酮類物質(zhì)得率和超聲波功率卻開始出現(xiàn)負(fù)向關(guān)系。這可能是因?yàn)槌暪β试龃?，其空化閾值也隨之升高，空化不易產(chǎn)生，且已空化的氣泡無充分時(shí)間發(fā)生爆裂，空化強(qiáng)度減弱。綜合考慮，最終選擇超聲波功率230 W進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.3 超聲波浸提時(shí)間對(duì)藜麥黃酮類物質(zhì)得率的影響

超聲波浸提時(shí)間對(duì)藜麥黃酮類物質(zhì)得率的影響見圖4。

圖4 超聲波浸提時(shí)間對(duì)藜麥黃酮類物質(zhì)得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic extraction time on the yield of quinoa flavonoids

由圖4可知，超聲波浸提時(shí)間與黃酮類物質(zhì)得率呈現(xiàn)正向關(guān)系，而到達(dá)28 min之后，即使提取時(shí)間再延長(zhǎng)，黃酮類物質(zhì)得率不再上升，甚至后期略微有所下降。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間延長(zhǎng)使得藜麥中的其他一些醇溶性物質(zhì)溶出，如酚類、生物堿等，這些物質(zhì)會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性的和乙醇溶液結(jié)合，而使黃酮類物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)減少。所以最終選擇以超聲波提取時(shí)間28 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.4 乙醇濃度對(duì)藜麥黃酮類物質(zhì)得率的影響

乙醇濃度對(duì)藜麥黃酮類物質(zhì)得率的影響見圖5。

圖5 乙醇濃度對(duì)藜麥黃酮類物質(zhì)得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on yield of flavonoids in quinoa

由圖5可知，在乙醇濃度到達(dá)78%之前，兩者呈現(xiàn)正向關(guān)系，而在78%后，乙醇濃度與黃酮類物質(zhì)得率開始出現(xiàn)負(fù)向關(guān)系，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)橐掖紳舛冗^高使得藜麥中除了黃酮類物質(zhì)以外的其他醇溶性生物活性物質(zhì)大量溶出，使得黃酮類物質(zhì)在提取液干物質(zhì)中占比減少。綜合考慮，以78%乙醇濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)4個(gè)因素，料液比、超聲波功率、乙醇濃度、超聲波浸提時(shí)間進(jìn)行分析，每個(gè)因素分別選取3個(gè)水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以藜麥黃酮類物質(zhì)的得率為參考依據(jù)，確定各因素的最佳參數(shù)條件，從而實(shí)現(xiàn)工藝優(yōu)化，獲得更高的得率。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

由表2，將各個(gè)因素的極差值大小進(jìn)行對(duì)比，乙醇濃度對(duì)黃酮類物質(zhì)得率影響最強(qiáng)，而超聲波浸提時(shí)間對(duì)黃酮類物質(zhì)得率的影響最弱，影響性排序?yàn)镈＞B＞A＞C。通過正交試驗(yàn)結(jié)果，最優(yōu)組合為A2B3C2D2，然而該組合并未在9組正交試驗(yàn)范圍內(nèi)，所以需要對(duì)該組合進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)由正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)組合A2B3C2D2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，見表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)Table 3 Verification test

根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，比較A2B3C2D2、A2B3C1D2兩種組合，以黃酮類物質(zhì)得率為判定依據(jù)，最終選擇A2B3C1D2組合，即料液比為 1∶52（g/mL），超聲波功率245 W，乙醇濃度78%，超聲波浸提時(shí)間24 min，在該參數(shù)條件下，黃酮類物質(zhì)得率達(dá)到了0.280%。

2.5 藜麥黃酮類物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果評(píng)價(jià)

2.5.1 抑菌圈測(cè)量結(jié)果

藜麥黃酮類物質(zhì)抑菌圈直徑測(cè)定見表4。

由表4可知，藜麥黃酮類物質(zhì)具有明顯的抑制作用，并且兩者呈現(xiàn)正向關(guān)系，抑菌作用隨著黃酮類物質(zhì)濃度的增大而顯著增強(qiáng)。

表4 藜麥黃酮類物質(zhì)抑菌圈直徑測(cè)定Table 4 Determination of bacteriostatic zone diameter of quinoa flavonoids mm

2.5.2 二倍稀釋法測(cè)得MIC值

96U型孔板每孔吸光度前后差值見表5。

表5 96U型孔板每孔吸光度前后差值Table 5 Absorbance difference before and after each hole of 96U orifice plate

由表5可知，第6孔即藜麥黃酮類物質(zhì)濃度在7.500 mg/mL時(shí)，ΔA值剛好＜0.2，濃度升高其ΔA值減小，濃度降低其ΔA值增大，綜上所述，藜麥黃酮類物質(zhì)的提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度MIC值為7.500 mg/mL。藜麥黃酮類物質(zhì)的提取液采用60℃減壓濃縮方式進(jìn)行制備，其中的乙醇溶液基本揮發(fā)完全，因此由乙醇產(chǎn)生的抑菌效應(yīng)可以忽略不計(jì)。

3 結(jié)論

在料液比為 1∶52（g/mL），超聲波功率 245 W，乙醇濃度78%、超聲波浸提時(shí)間24min的工藝條件下，藜麥黃酮類物質(zhì)的得率最高，達(dá)到了0.280%。通過打孔法對(duì)抑菌圈進(jìn)行測(cè)定，藜麥黃酮類物質(zhì)乙醇提取液與抑菌效果呈現(xiàn)出正向作用，抑菌效果隨著黃酮類物質(zhì)濃度的遞增表現(xiàn)出明顯的增強(qiáng)態(tài)勢(shì)，在藜麥黃酮類物質(zhì)濃度達(dá)到44 mg/100 g時(shí)，其抑菌圈直徑可達(dá)11.3 mm。通過二倍稀釋法測(cè)金黃色葡萄球菌的MIC值，得出藜麥黃酮類物質(zhì)的乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度MIC值為7.500 mg/mL。