李緒倫，任學(xué)毅

(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121)

青霉素V鉀片可用于對青霉素敏感菌株所產(chǎn)生的輕、中度感染如扁桃體炎、咽喉炎、支氣管炎、肺炎等疾病的治療[1-2]。本研究擬按《中國藥典》2020年版(四部)非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法、控制菌檢查法進行適用性試驗[3-4]，建立青霉素V鉀片的微生物限度檢查方法，供同行在工作中參考。

1 材料與儀器

青霉素V鉀片[重慶科瑞制藥(集團)有限公司，批號429001，規(guī)格0.236 g]；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號190516)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號190504)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號1904102)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號1903162)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號190510)均由北京三藥科技開發(fā)公司提供；電子天平[梅特勒托利多儀器(上海)有限公司]；生化培養(yǎng)箱(重慶四達實驗儀器公司)；高壓蒸汽滅菌器(日本HIRAYAMA儀器制造公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)

2.1.1 菌液制備 取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌液體培養(yǎng)物分別用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液；取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)24 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液，作活菌計數(shù)備用。取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)6 d的黑曲霉菌斜面培養(yǎng)物，加入含0.05%(體積比)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。吸出懸液(用管口帶有薄無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管)到無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液配成適宜濃度的孢子懸液，備用。

2.1.2 需氧菌總數(shù)計數(shù) 試驗組：方法一，稱取樣品10 g，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液到100 mL，混勻，靜置30 min，吸取上清液作為1∶10的供試液[3]。吸取1 mL到50 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，進行薄膜過濾，再用0.1%蛋白胨緩沖液600 mL分6次沖洗(每次100 mL)，在末次沖洗液中加入1 mL含菌量≤100 cfu的試驗菌，將薄膜貼在胰酪大豆胨瓊脂平板上，按規(guī)定溫度進行培養(yǎng)，然后記錄結(jié)果。方法二，吸取1 mL供試液到50 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，進行薄膜過濾，再用0.1%蛋白胨緩沖液800 mL分8次進行沖洗(每次100 mL)，在末次沖洗液中加入 1 mL 含菌量≤100 cfu的試驗菌，將薄膜貼在胰酪大豆胨瓊脂平板上(每200 mL含400萬單位青霉素酶)，按規(guī)定溫度進行培養(yǎng)，然后記錄結(jié)果。方法三，吸取1 mL供試液到50 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，進行薄膜過濾，再用0.1%蛋白胨緩沖液800 mL分8次進行沖洗(每次100 mL)，在末次沖洗液中加入 1 mL 含菌量≤100 cfu的試驗菌，將薄膜貼在胰酪大豆胨瓊脂平板(每200 mL含1 000萬單位青霉素酶)，按規(guī)定溫度進行培養(yǎng)，然后記錄結(jié)果。

菌液組：用稀釋液代替供試液，與試驗組的操作相同(培養(yǎng)基不含青霉素酶)，按規(guī)定溫度進行培養(yǎng)，然后記錄結(jié)果。

供試液對照組：用稀釋液代替菌液，與試驗組的操作相同，按規(guī)定溫度進行培養(yǎng)，然后記錄結(jié)果。

稀釋劑對照組：用稀釋液代替供試液，與試驗組的操作相同，按規(guī)定溫度進行培養(yǎng)，然后記錄結(jié)果。

陰性對照組：用稀釋液代替供試液、菌液，與供試液對照組的操作相同，按規(guī)定溫度進行培養(yǎng)，然后記錄結(jié)果。另做空白對照。

菌株回收率(0.5～2.0)=(試驗組菌數(shù)-供試液對照組菌數(shù))/菌液組菌數(shù)。見表1。

2.1.3 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù) 試驗組：方法一，稱取樣品10 g，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液到 100 mL 制成1∶10的供試液，加入適宜濃度的菌懸液使每1 mL供試液含菌量≤100 cfu，混勻，再吸取1 mL到平皿中，依法檢查，觀察記錄結(jié)果。方法二，稱取樣品2 g，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液到100 mL制成濃度為1∶50的供試液，加入適宜濃度的菌懸液使每 1 mL 供試液含菌量≤100 cfu，混勻，再吸取1 mL到平皿中，立即倒入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，按規(guī)定溫度進行培養(yǎng)，觀察記錄結(jié)果。

表1 需氧菌總數(shù)計數(shù)試驗結(jié)果

菌液組：用稀釋液作供試液，與試驗組進行相同操作，按規(guī)定溫度進行培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

供試液對照組：以稀釋液代替菌液同實驗組操作，按規(guī)定溫度進行培養(yǎng)，觀察記錄結(jié)果。

陰性對照組：用稀釋液代替供試液、菌液，與試驗組進行相同操作，按規(guī)定溫度進行培養(yǎng)，觀察記錄結(jié)果。另做空白對照。

菌株回收率(0.5～2.0)=(試驗組菌數(shù)-供試液對照組菌數(shù))/菌液組菌數(shù)。見表2。

2.1.4 方法適用性試驗結(jié)果 本品按《中國藥典》2020年版(四部)通則[4]的需氧菌、霉菌和酵母菌數(shù)總數(shù)計數(shù)方法進行適用性試驗，3次平行試驗結(jié)果顯示，本品對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草桿菌均有抑菌作用，依法配制成供試液進行薄膜過濾后，用0.1%蛋白胨緩沖液800 mL分8次進行沖洗(每次100 mL)，再將膜貼于胰酪大豆胨瓊脂平板(每200 mL含1 000萬單位青霉素酶)進行計數(shù)檢查的方法，可以較好去除本品的抑菌性[5]。本品對白色念珠菌、黑曲霉無明顯抑菌作用。

表2 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)試驗結(jié)果

2.2 大腸埃希菌檢查

取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)24 h的大腸埃希菌[CMCC(B)44102]胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每毫升含≤100 cfu的菌懸液備用。稱取樣品10 g，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液到100 mL，混勻，靜置，吸取上清液作為1∶10供試液備用。

試驗組：方法一，吸取1∶10供試液10 mL到100 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，薄膜過濾，用0.1%蛋白胨緩沖液500 mL分5次進行沖洗(每次100 mL)，在末次沖洗液中加入1 mL含菌量≤100 cfu大腸埃希菌菌懸液，將膜放入100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依法檢查，觀察結(jié)果。方法二，吸取1:10供試液10 mL到100 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，薄膜過濾，用0.1%蛋白胨緩沖液800 mL分8次進行沖洗(每次 100 mL)，在末次沖洗液中加入1 mL含菌量≤100 cfu大腸埃希菌菌懸液，將膜放入100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依法檢查，觀察結(jié)果。

樣品組：以稀釋液代替菌液，同試驗組進行相同操作，觀察結(jié)果。

陽性對照：以稀釋液代替供試液，同試驗組進行相同操作，觀察結(jié)果。

陰性對照：以稀釋液代替供試液、菌液，同試驗組進行相同操作，觀察結(jié)果。

結(jié)果見表3。本品按《中國藥典》2020年版(四部)通則[4]進行大腸埃希菌檢查方法適用性試驗，結(jié)果顯示，本品對大腸埃希菌均有較強抑菌作用，采用吸取 1∶10 供試液10 mL到100 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，進行薄膜過濾后，用0.1%蛋白胨緩沖液 500 mL 分5次沖洗(每次100 mL)，再將膜放入100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中檢查的方法，可以較好地去除本品對大腸埃希菌的抑菌性。

表3 大腸埃希菌驗證試驗結(jié)果

2.3 結(jié)論

青霉素V鉀片按《中國藥典》2020年版(四部)通則[4]進行的微生物限度檢查方法適用性試驗，試驗結(jié)果顯示可采用如下方法進行檢查[6]：稱取本品10 g，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液到100 mL，搖勻，靜置30 min，吸取上清液作為1∶10的供試液。取1∶10的供試液1 mL到50 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，進行薄膜過濾后，再用0.1%的蛋白胨緩沖液 800 mL 分8次沖洗(每次100 mL)，將薄膜貼在胰酪大豆胨瓊脂平板上(每200 mL含1000萬單位青霉素酶)，依法進行需氧菌總數(shù)計數(shù)；吸取1∶10的供試液1 mL，依法進行霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)；吸取1∶10供試液 10 mL 到100 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，進行薄膜過濾，再用0.1%蛋白胨緩沖液500 mL分5次沖洗(每次100 mL)，將薄膜放入100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，依法進行大腸埃希菌檢查。樣品檢查結(jié)果應(yīng)符合《中國藥典》2020年版(四部)規(guī)定[4]。

3 討論

本試驗采用薄膜過濾法，是為了減少供試液基質(zhì)或輔料在過濾過程中堵塞濾膜，導(dǎo)致過濾不暢、過濾時間延長或抽壞濾膜，從而使沖洗液不能進行有效過濾。這是因為供試液存在一個沉降系數(shù)的問題，而沉降系數(shù)又與菌的形態(tài)、大小、種類等有關(guān)，因此不同菌種采用低速離心后所得到的回收率差異較大，嚴(yán)重影響了檢驗的結(jié)果[7-9]。同時在進行低速離心試驗時，樣品里的不溶性物質(zhì)對樣品中所含的微生物還具有一定的攜帶作用[3]，尤其當(dāng)制劑中含有不溶性輔料時，其攜帶作用更強。因此，本品在試驗過程處理中不可采用離心沉淀法，建議試驗過程中采用靜置吸取其上清液[8]進行薄膜過濾。

由于青霉素V鉀片屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，對細菌具有較強抗菌活性，但對真菌無抗菌活性，青霉素酶可以在一定程度消除其抗菌活性，故可采用薄膜過濾法與中和法聯(lián)用進行檢查。同時對于β-內(nèi)酰胺類抗生素均可采用β-內(nèi)酰胺酶消除其抗菌活性的檢查方法再加上薄膜過濾能有效的消除青霉素類藥物的抗菌活性。控制菌檢查采用薄膜過濾法，應(yīng)根據(jù)《中國藥典》2020年(四部)[4]要求在方法中明確沖洗后濾膜接種至胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基的體積[7，10]。由于各個廠家產(chǎn)品處方工藝存在一定差異，導(dǎo)致其抑菌程度不盡相同，可能加酶的濃度和沖洗的量及次數(shù)也不盡相同，但大致的方向是可以借鑒的。該法可為不同廠家生產(chǎn)的同類藥品的微生物限度檢查方法驗證提供參考[6]。