付平，吳天祥,2*，吳力亞，李鳳蘭，李潮云

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽 550025）（2.貴州食品工程職業(yè)學(xué)院食品工程系，貴州清鎮(zhèn) 551400）

香禾糯（Oryza sativa L.），國際標準譯名為“Kam Sweet Rice”，是貴州省黔東南州山區(qū)特殊生態(tài)類型珍稀水稻品種，聯(lián)合國糧農(nóng)組織稱其為世界“特產(chǎn)稻”（Specialty Rice）[1]。香禾糯生長于陰、涼、爛、銹的山地水田中，無需施加化肥，以傳統(tǒng)生態(tài)農(nóng)業(yè)稻-鴨-魚模式種植，有“一畝稻花十里香，一家烹食十戶香”的稱贊，被譽為“糯中之王”[2]。2009年香禾糯榮獲國家地理標志保護產(chǎn)品“黎平香禾糯”的榮譽稱號[3]。香禾糯經(jīng)過“糯禾改秈稻”、大量勞動力進城務(wù)工、外來文化沖擊與當?shù)啬贻p群體對于自身民族文化認同感下降等原因造成黎平縣、從江縣為主要種植產(chǎn)區(qū)的香禾糯種植面積從新中國成立占比80%、82%分別下降到2015年的2%、6%，黔東南苗族侗族自治州在2015年的香禾糯品種相比于1981年的香禾糯品種減少了71.9%[4]。

目前，關(guān)于香禾糯研究主要側(cè)重于遺傳學(xué)、民族學(xué)、生態(tài)學(xué)，然而對于挖掘香禾糯的營養(yǎng)價值、開發(fā)副產(chǎn)品、提升經(jīng)濟效益的研究較少[2,5-9]。傳統(tǒng)香禾糯酒的釀造特點，結(jié)合了發(fā)酵酒與蒸餾酒的釀造工藝，從而具備了白酒主體風格以及發(fā)酵酒對于營養(yǎng)成分保留的特征。香禾糯酒口感綿柔醇厚、甘甜細膩與傳統(tǒng)白酒入口辛辣形成鮮明對比，適合初飲者、女性消費者和當?shù)芈糜尉皡^(qū)游客的飲用，在黎平縣十分暢銷，具有較大的市場潛力。如何實現(xiàn)拓展香禾糯原料深加工，擺脫香禾糯單一的銷售方式，提高香禾糯種植農(nóng)戶的經(jīng)濟收益以及緩解香禾糯品種與種植面積遞減趨勢是迫切解決的問題。

本文通過探究傳統(tǒng)香禾糯酒的基本理化指標、微量元素含量、氨基酸含量、揮發(fā)性風味組分以及體外抗氧化能力并與巖洞當?shù)匕拙七M行對比。進而挖掘香禾糯酒的營養(yǎng)價值與功能活性，為開發(fā)香禾糯酒提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香禾糯酒、普通白酒，均購自巖洞鎮(zhèn)；苯酚、福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH、2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽ABTS，購于北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為分析純，購于國內(nèi)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752N型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；PHS-3C型PH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；X2型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS），賽默飛世爾科技有限公司；S-433D型氨基酸自動分析儀，塞卡姆公司；HP6890/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），安捷倫公司。

1.3 傳統(tǒng)香禾糯泡酒釀造工藝流程

操作要點，首先將精選大米蒸煮，取出攤涼冷卻至30 ℃左右，加入1%酒曲于28 ℃發(fā)酵14 d，通過蒸餾得到普通白酒；其次進行香禾糯醪液的制作，先將香禾糯用水浸泡12 h，待其瀝干，蒸煮至熟而不爛，內(nèi)無生心，攤涼至30 ℃左右，加入0.16%甜酒曲于28 ℃發(fā)酵48 h。將得到醪液與白酒按1:1的比例混合陳釀半年，得到成品香禾糯酒。

1.4 試驗方法

1.4.1 酒精度的測定

參照趙旭[10]的方法進行蒸餾測定。

1.4.2 總糖的測定

參考郭雷[11]運用苯酚-硫酸法測定總糖，略有改動。

1.4.3 總酸、氨基酸態(tài)氮的測定

參考《黃酒》GB/T 13662-2018法[12]進行測定。

1.4.4 可溶性固形物的測定

參考趙旭[10]的方法進行測定。

1.4.5 蛋白質(zhì)的測定

參考李志江[13]和Konstantinos等[14]的考馬斯亮藍G-250蛋白質(zhì)測定方法。

1.4.6 總多酚的測定

參考張強[15]用福林酚比色法測定總多酚。

1.4.7 總黃酮的測定

參考王佳麗[16]用硝酸銀顯色法測定總黃酮。

1.4.8 微量元素含量的測定

運用ICP-MS對酒樣中的Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Se、Cd、Pb礦物元素含量進行分析檢測，首先精確稱取15 g酒樣于250 mL的蒸餾燒瓶內(nèi)，使其在250 ℃的加熱套，受熱蒸發(fā)至1～2 mL，待冷卻后向其加入10 mL的硝酸，直至保留少量液體到近干，待冷卻后用純凈水多次沖洗蒸餾燒瓶，于25 mL的棕色容量瓶內(nèi)保存[17]。最后進樣檢測，用ICP-MS Data Cal軟件對得到的數(shù)據(jù)進行處理。

1.4.9 氨基酸含量的測定

采用氨基酸自動分析儀對酒樣中的天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸等氨基酸及其衍生氨基酸的測定。儀器的保留時間重現(xiàn)性CV0.3%（精氨酸），峰面積重現(xiàn)性CV1.0%（甘氨酸，組氨酸），檢出限3 pmol（信噪比為2，天冬氨酸）。

1.4.10 揮發(fā)性風味組分的測定

采用GC-MS聯(lián)用儀對酒樣中的各揮發(fā)性風味組分的含量進行測定。取混勻樣品2 mL，置于固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm～50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器，在60 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min時間后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度250 ℃）中，熱解析1 min進樣。爾后，對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist17和Wiley275標準質(zhì)譜圖，確定了檢測到揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法測定了各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分數(shù)。

1.4.11 DPPH自由基清除能力的測定

參考JIANG等[18]、楊祖滔等[19]的方法略有改動，以0.1 mg/mL的Vc溶液作為陽性對照，上述實驗均設(shè)3組水平。

式中：

A1——樣品測定管吸光度；

A2——樣品本底管吸光度；

加快推進全市基礎(chǔ)行業(yè)和優(yōu)勢行業(yè)的轉(zhuǎn)型升級和提質(zhì)增效。發(fā)揮百色鋁產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢，合理開發(fā)利用鋁土礦資源，著力構(gòu)建鋁產(chǎn)業(yè)鏈和配套產(chǎn)業(yè)鏈。加快淘汰冶煉行業(yè)落后產(chǎn)能、改造提升技術(shù)裝備水平；整合全市礦產(chǎn)資源，發(fā)展鋁銅深加工行業(yè)。全面提升鋁加工行業(yè)的整體競爭力，加快發(fā)展高性能、綠色環(huán)保的精細化工產(chǎn)品和高端化工新材料產(chǎn)品。加強與貴州、云南區(qū)域間的電力合作，實現(xiàn)優(yōu)勢互補，降低工業(yè)用電成本。提升改造傳統(tǒng)建材行業(yè)，突破發(fā)展新興建材行業(yè)。

A0——空白對照液吸光度。

1.4.12 ABTS自由基清除能力的測定

參考方晟等[20,21]方法略有改動，以1 mg/mL的Vc溶液稀釋100倍作為陽性對照，上述實驗均設(shè)3組水平。

式中：

A1——樣品測定管吸光度；

A2——樣品本底管吸光度；

A0——空白對照液吸光度。

參考李清清等[22]的方法，以1 mg/mL的Vc溶液作為陽性對照，上述實驗均設(shè)3組水平。

式中：

A1——樣品測定管吸光度；

A2——樣品本底管吸光度；

A0——空白對照液吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與討論

2.1 香禾糯酒基本理化指標

通過測定香禾糯酒基本理化指標可知，香禾糯酒酒度為29.00% vol，酒度適宜稍偏低，適飲消費者群體相比普通白酒更廣；香禾糯酒總酸含量適當，酸味能賦予酒體層次感，使酒體口感更加豐富；香禾糯酒含有0.20 g/L的氨基酸態(tài)氮、13.70 g/L的非糖可溶性固形物、46.30 g/L的總糖、0.35 g/L的蛋白質(zhì)，以及含有0.27 g/L的多酚和0.0026 g/L黃酮，表明香禾糯酒營養(yǎng)較為豐富，且含有一定黃酮、多酚等抗氧化功能活性成分，基本理化指標與黃酒相似[23]。其原因可能是，香禾糯酒將發(fā)酵的香禾糯醪液轉(zhuǎn)移到普通白酒，從而使普通白酒度被稀釋，達到降度的作用。同時，加入的香禾糯醪液，能賦予普通白酒更加豐富的口感、風味，以及多種營養(yǎng)物質(zhì)與抗氧化功能活成分。

表1 香禾糯酒的基本理化指標Table 1 Physico chemical indexes of Kam sweet rice wine

2.2 香禾糯酒與普通白酒微量元素含量的對比

從圖1結(jié)果可以看出，香禾糯酒中錳、鐵、鎳、鋅等人體必需的微量元素以及硒3.15 μg/L含量要明顯高于普通白酒[24]。對于鉛、鎘等對人體有害的重金屬元素，兩種酒樣中鉛、鎘含量，均符合且遠低于國家要求標準鉛含量（以Pb計，<0.50 mg/L）和鎘含量（以Cd計，<0.05 mg/L）。其原因是，香禾糯酒以普通白酒為基酒，將香禾糯米發(fā)酵形成的醪液中的錳、鐵、鎳、鋅等人體必需微量元素，轉(zhuǎn)移到香禾糯酒中，從而使香禾糯酒中必需微量元素多于普通白酒。這與柴東方等[25]在測得香禾糯中富含多種必需微量元素相符。香禾糯生長于山區(qū)水田，生態(tài)環(huán)境優(yōu)良，不施加化肥，環(huán)境中所含的有害重金屬低，從而鉛、鎘等有害重金屬元素含量極低。

圖1 兩種不同酒中各元素的含量Fig.1 The content of each element in two different wines

2.3 香禾糯酒與普通白酒的氨基酸種類及含量測定結(jié)果

圖2 氨基酸離子圖譜Fig.2 Amino acid ion profile

由上表的結(jié)果可知，香禾糯酒中檢測到14種氨基酸，其中必需氨基酸有蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等6種必需氨基酸，必需氨基酸總含量為24.64 mg/100 g，總氨基酸含量為139.24 mg/100 g；普通白酒中共測出2種氨基酸含量為6.24 mg/100 g，1種必需氨基酸甲硫氨酸含量為0.39 mg/100 g[26]，表明香禾糯酒中氨基酸的種類與含量均高于普通白酒。原因是香禾糯在發(fā)酵過程中，由于細菌、霉菌和酵母菌等微生物分泌的蛋白酶，將香禾糯中大分子蛋白質(zhì)分解為小分子的肽鏈與氨基酸，以及微生物在生長代謝與自溶產(chǎn)生氨基酸，通過香禾糯醪液轉(zhuǎn)移到香禾糯酒中。相比之下普通白酒經(jīng)過蒸餾，造成大量的氨基酸減損[27]。普通白酒經(jīng)過蒸餾，大量營養(yǎng)成分未能得到保留，只有較少部分營養(yǎng)物質(zhì)在蒸餾時同乙醇或水汽化到酒里，解釋了普通白酒含有少量氨基酸的原因，與張莊英等[28]研究不同香型白酒中游離氨基酸含量較少的結(jié)果相符。普通白酒僅含有較少氨基酸，根據(jù)釀造工藝在向其加入1:1比例的香禾糯醪液后，普通白酒中氨基酸被稀釋變得更少，氨基酸含量不能達到儀器檢測限。從而解釋普通白酒中檢測到少量的脯氨酸和甲硫氨酸而香禾糯酒中未檢測到這兩種氨基酸。

表2 香禾糯酒與普通白酒中所含的氨基酸（mg/100 g）Table 2 Amino acids contained in Kam sweet rice wine and Baijiu

2.4 揮發(fā)性風味組分的測定結(jié)果

通過GC-MS檢測分析得到香禾糯酒與普通白酒中各檢測到45與48種揮發(fā)性風味物質(zhì)，普通白酒比香禾糯酒多檢測出4種揮發(fā)性風味成分，分別為戊酸乙酯、乙酸己酯、(Z)-2-庚醛、反-2-壬烯醛，香禾糯酒比普通白酒多檢測到1種糠醛。其原因可能是，雖然普通白酒中檢測到的揮發(fā)性風味成分比香禾糯酒多，但其所占的百分含量都較低，最高百分含量0.031%，最低百分含量僅有0.004%。根據(jù)釀造工藝將香禾糯發(fā)酵醪液與普通白酒按1:1的比例勾調(diào)陳釀，使普通白酒中微量的揮發(fā)性成分被稀釋，其含量占比更低，故達不到儀器的最低檢測限。香禾糯酒中檢出的糠醛可能來自于香禾糯發(fā)酵過程中氨基酸和脂質(zhì)降解形成[29]，跟隨香禾糯醪液轉(zhuǎn)移到香禾糯酒中，適當?shù)目啡┖磕苜x予酒杏仁香[30]。

圖3 香禾糯酒總離子流圖Fig.3 Total ion current diagram of Kam sweet rice wine

圖4 普通白酒總離子流圖Fig.4 Total ion current diagram of Baijiu

醇類作為香禾糯酒揮發(fā)性風味物質(zhì)的主體成分，香禾糯酒中有14種醇總百分含量為92.84%，普通白酒中有13種醇總百分含量為92.97%，醇類化合物能使酒體豐滿，有些醇類能予以酒甘甜的口感，同時也是酯類化合物的前驅(qū)物質(zhì)[31]；酯類作為主要呈香呈味組分香禾糯酒中有16種總百分含量為3.88%，普通白酒中有18種總百分含量為4.02%，雖然占比不高但卻尤為關(guān)鍵，是區(qū)分各種香型酒的特征成分。如濃香型白酒的主體香是己酸乙酯，清香型白酒特有的重要香氣成分辛酸乙酯[32]；醛類香禾糯酒中有6種總百分含量為0.50%，普通白酒中有8種總百分含量為0.26%，其來源可能來自香禾糯原料及酒曲或醇類氧化、氨基酸與還原糖的美拉德反應(yīng)[33]；酸類可以賦予酒體更加厚重、豐富、協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)香氣，同時也是脂類的前驅(qū)物質(zhì)，在香禾糯酒中有5種總百分含量為0.23%，普通白酒中有5種總百分含量為0.22%；香禾糯酒和普通白酒中烷烴類與酮類種類及含量都較少對酒體風味貢獻也少，各都有2種總百分含量為0.04%、0.02%和0.03%、0.03%。

圖5 兩種酒中揮發(fā)性組分對比Fig.5 Comparison of volatile components in two wines

表3 揮發(fā)性風味成分Table 3 Volatile flavor components

接上頁

2.5 DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果

由圖6的DPPH自由的清除能力的測定結(jié)果表明，香禾糯酒的DPPH自由基清除率與0.1 mg/mL Vc的清除能力相接近，在添加到1.8 mL時清除率達95.68%，且兩者的清除率顯著高于普通白酒的清除率，說明普通白酒DPPH自由基清除率較弱。其原因可能是白酒經(jīng)過高溫蒸餾，在蒸餾前積累的功能活性成分損耗。而香禾糯酒中包含未經(jīng)蒸餾的香禾糯發(fā)酵醪液，醪液中富含黃酮、多酚等功能活性成分，因而在DPPH自由基清除能力試驗中表現(xiàn)出較強的抗氧化能力。

圖6 香禾糯酒、普通白酒、Vc清除DPPH自由基的能力Fig.6 The ability of Kam sweet rice wine, Baijiu, and Vc to scavenge DPPH free radicals

2.6 ABTS自由基清除能力的測定結(jié)果

由圖7的ABTS自由基清除能力的測定結(jié)果，香禾糯酒在稀釋10倍后與稀釋100倍Vc 1 mg/mL以及普通白酒，在添加相同體積下的ABTS自由基清除率表明，在添加0.1 mL到0.9 mL階段香禾糯酒的ABTS自由基清除率要高于Vc和普通白酒，后趨于穩(wěn)定，最大清除率達到83.20%且在稀釋10倍后，高于普通白酒49.27%的最大清除率。香禾糯酒在稀釋10倍后與普通白酒相比，仍然表現(xiàn)出較強ABTS自由基清除能力的原因，極有可能是因為香禾糯醪液含有的抗氧成分，遷移到香禾糯酒中而表現(xiàn)出相比于普通白酒較強ABTS自由基清除能力。

圖7 香禾糯酒、普通白酒、Vc清除ABTS自由基的能力Fig.7 The ability of Kam sweet rice wine, Baijiu and Vc to scavenge ABTS free radicals

2.7 OH自由基清除能力的測定結(jié)果

由圖8結(jié)果顯示，在OH自由基清除能力對比上，香禾糯酒、Vc 1 mg/mL和普通白酒在相同添加的體積下，Vc清除OH自由基清除率最高，在添加到0.6 mL時清除率趨于平穩(wěn)，最大清除率為99.44%；香禾糯酒的由基清除率在添加體積0.9 mL后清除率顯現(xiàn)出較為平緩的趨勢，最大清除率達到97.17%，且顯著高于普通白酒。通過OH自由基清除能力試驗，進一步驗證了香禾糯醪液中的抗氧化組分，在轉(zhuǎn)移到普通白酒后，兩者通過陳釀半年得到香禾糯酒，而表現(xiàn)出較強抗氧化能力。

圖8 香禾糯酒、普通白酒、Vc清除OH自由基的能力Fig.8 The ability of Kam sweet rice wine, Baijiu, and Vc to scavenge ·OH radicals

通過對3種自由基的清除能力的測定，表明香禾糯酒有一定的自由基清除能力，這可能與酒中測出的黃酮[34]、多酚[35]等功能活性成分有關(guān)，與郭睿等[36]研究黃酒具有較強的抗氧化能力的結(jié)論基本相符。其原因可能是普通白酒經(jīng)過高溫蒸餾，造成其營養(yǎng)成分與功能活性物質(zhì)例如酚類、黃酮類損耗。相比之下香禾糯酒中含有香禾糯醪液，香禾糯醪液將本身具有較強抗氧化能力的酚類與黃酮類帶到酒中，使香禾糯酒表現(xiàn)出較強的抗氧化能力，從而解釋了香禾糯酒對3種自由基的清除能力強于普通白酒。

3 結(jié)論

針對當下人們對酒的需求是降度、健康、營養(yǎng)、低耗糧、低耗能的的背景下，香禾糯酒正好吻合形勢需求。香禾糯酒不僅保留了蒸餾酒的主體風味特征，而且兼有發(fā)酵酒對于營養(yǎng)物質(zhì)及功能活性成分的保留優(yōu)勢。試驗結(jié)果表明，香禾糯酒在揮發(fā)性風味成分上與普通白酒相似，兩者各檢測到45與48種揮發(fā)性風味物質(zhì)。其酒體基本理化指標、營養(yǎng)成分都與發(fā)酵型黃酒十分接近。香禾糯酒中氨基酸種類與含量、必需微量元素含量均高于普通白酒。在香禾糯酒中檢測到黃酮、多酚等抗氧化功能活性物質(zhì)，通過測定DPPH自由基、ABTS自由基和OH自由基3種自由基清除能力試驗，驗證了香禾糯酒的抗氧化能力顯著高于普通白酒。后期研究將對香禾糯酒揮發(fā)性風味的主成分進行分析，以及體內(nèi)抗氧化活性試驗，進一步檢驗其抗氧化能力。為挖掘香禾糯酒營養(yǎng)價值與功能活性價值，開發(fā)香禾糯原料深加工提供數(shù)據(jù)支撐。