穆文靜，劉培，尹會(huì)敏，栗慧，孫豐梅，郭芬芳，白升，魏東*

（1.河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北張家口 075000）（2.張家口市宣化區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北張家口 075000）

隨著人們生活水平的不斷提高，對(duì)動(dòng)物性食品的需求量也隨之增大，養(yǎng)殖戶在利益的驅(qū)動(dòng)下，抗生素濫用的情況越來越嚴(yán)重，常常在動(dòng)物體內(nèi)造成大量殘留，人類食用了含有抗生素殘留的動(dòng)物源性食品后，身體健康受到嚴(yán)重危害，因此建立一種超靈敏檢測(cè)抗生素殘留的生物條形碼技術(shù)十分必要。達(dá)氟沙星（Danofloxacin，DFLX）又名單諾沙星，是氟喹諾酮藥物中的一種[1,2]。常常被用于治療畜禽動(dòng)物的疾病，導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)藥物殘留量超標(biāo)。因此DFLX不僅存在被濫用的風(fēng)險(xiǎn)，而且它的濫用也會(huì)導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的后果，如增加細(xì)菌的耐藥性、危害動(dòng)物源食品安全和人類藥物資源，并且有可能對(duì)人體安全造成直接危害[3-5]。ENLX、DFLX、SALX、鹽酸二氟沙星均屬于獸類專用藥[6]。目前，獸藥殘留量的檢測(cè)方法主要有：微生物法和儀器分析法[7]。微生物法檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低，該方法只適合用做初步篩選使用；儀器分析法檢測(cè)靈敏度雖高，但需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作人員，因此很難被廣泛應(yīng)用。近幾年，隨著動(dòng)物源性食品中獸藥殘留超標(biāo)事件的頻頻發(fā)生，甚至在動(dòng)物體內(nèi)存在含量較小的抗生素，傳統(tǒng)的技術(shù)手段很難檢測(cè)出來，因而建立一種快速、高效的藥物殘留檢測(cè)方法是十分必要的。

2003年Mirkin課題組首次提出了生物條形碼檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)的突出特點(diǎn)是具有極高的敏感度，在微量物質(zhì)的檢測(cè)中有著廣泛的應(yīng)用前景[8,9]。在生物條形碼檢測(cè)體系中，一般應(yīng)用到兩種功能化的納米粒子分別是磁性微珠（magnetic microparticles，MMP）和金納米顆粒（GNPs）[10]。本研究將單克隆抗體修飾在激活的磁珠表面制成磁性探針，多克隆抗體和雙鏈DNA修飾在金納米顆粒表面制成金納米探針，當(dāng)待測(cè)物中含有DFLX時(shí)，三者雜交形成MMP-DFLX-NP“三明治”結(jié)構(gòu)，經(jīng)過磁性分離釋放出生物條形碼DNA鏈，對(duì)釋放的DNA建立基于微孔板銀染的生物條形碼檢測(cè)技術(shù)方法進(jìn)行定量分析檢測(cè)。生物條形碼檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)且不需要昂貴的儀器設(shè)備、也不需要專業(yè)的技術(shù)人員等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的一種檢測(cè)技術(shù)手段，因此該技術(shù)未來具有良好的應(yīng)用價(jià)值和廣泛的發(fā)展空間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品（Danofloxacin，DFLX）、牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清蛋白（OVA）、N,N’-二甲基甲酰胺、TMB顯色液，購自美國(guó)Sigma公司；氯金酸（HAuCl4）、檸檬酸三鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；羧基磁珠，購自海貍生物科技有限公司；DNA鏈，均由上海生工生物有限公司合成；達(dá)氟沙星單克隆抗體，購自MCE公司；DFLX多克隆抗體，本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.2 儀器

酶標(biāo)儀、紫外分光光度計(jì)、透射電子顯微鏡、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)、磁力架等。

1.2 方法

1.2.1 納米金的制備及鑒定

納米金有多種制備方法，但目前應(yīng)用最廣泛的就是檸檬酸鈉還原法制備納米金。在開始制備納米金前需要將實(shí)驗(yàn)用到的所有玻璃器皿放入酸缸中浸泡一天一宿，取出后用自來水沖洗至少3遍，再用蒸餾水沖洗1遍，放置烘箱中烘干備用。取1 mL 1%氯金酸水溶液放入99 mL的超純水中充分混勻，將上述混合置于磁力攪拌器上邊攪拌邊加熱至沸騰，沸騰后迅速加入1.5 mL現(xiàn)配的1%檸檬酸三鈉溶液觀察其顏色變化，待顏色逐漸由黑灰色變?yōu)樽仙詈笞兂赏该鞯木萍t色時(shí)，停止加熱，將溶液冷卻至室溫重新定容于100 mL的容量瓶中恢復(fù)原體積，放置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 金納米探針（NP）制備

A液：取1 mL納米金溶液，分別加入不同濃度的多抗，篩選出添加抗體的最適量，用0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH至9.0，旋渦混勻15 min，而后加入5%的BSA作為穩(wěn)定劑，以防止膠體金和抗體發(fā)生團(tuán)聚。

B液：將巰基DNA鏈加到上述A液中，室溫靜置40 h，再用PBS調(diào)整pH至7.0，10000 r/min，離心15 min。

C液：將條形碼DNA鏈加到上述B液中，室溫雜交6 h，13000 r/min，離心20 min，得到NP探針。

1.2.3 磁性探針（MMP）制備

取1 mL磁珠在磁性條件下除去活化液，再加1 mL的15 mmol/L MES溶液清洗4次，磁分離后，迅速加入100 μL MES溶液和100 μL的EDC溶液均勻，25 ℃活化30 min；稱量200 μg單抗溶入20 mL的PBST緩沖液中，然后將其加入到激活的磁珠中，劇烈振蕩，靜置24 h，磁性分離，棄掉上清液。在40 mL的PBS中重懸磁珠，加入20 mL甘氨酸溶液，劇烈振蕩，反應(yīng)30 min，磁性分離，扔掉上清；用PBS清洗3次，磁性分離；加50 mL PBST重懸磁珠，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 檢測(cè)探針制備

首先用TE緩沖液將檢測(cè)探針DNA鏈溶解，按照1:200的比例和TCEP溶液混合，震蕩過夜。然后將上述檢測(cè)探針溶液加入到制備好的納米金溶液中混合均勻，室溫放置16 h。24 h內(nèi)分6次加入一定量的NaCl，靜置40 h。而后在4 ℃條件下10000 r/m，離心25 min，除去未結(jié)合的DNA鏈，最后加入1 mL的10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液混勻，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 制備MMP-DFLX-NP “三明治”結(jié)構(gòu)

取DFLX標(biāo)準(zhǔn)品10 μg加入到磁性探針溶液中使二者充分雜交，37 ℃劇烈振蕩1 h；磁場(chǎng)固定磁性探針（MMP），用PBS溶液清洗3～4次，除去未結(jié)合的DFLX抗原；加入納米金探針，形成三明治結(jié)構(gòu)，劇烈振蕩45 min；磁場(chǎng)固定MMP，用PBS多次清洗3～4次，以除去未結(jié)合的NP。在上述三明治結(jié)構(gòu)中加入無菌水，使DNA條形碼在60 ℃的條件下充分振蕩1 h，用磁場(chǎng)固定MMP，收集上清液，該上清液中含有生物條形碼。具體的生物條形碼制備過程如圖一所示。

1.2.6 建立微孔板銀染的生物條形碼檢測(cè)方法

在含有25 μL的生物條形碼溶液中加入20 μL雜交緩沖液，充分混勻，接著加入1 μL的生物素探針溶液，25 ℃反應(yīng)15 min；再吸取5 μL的檢測(cè)探針溶液加到上述混合液中充分反應(yīng)15 min，三者形成“三明治”復(fù)合物，將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到提前包被了鏈霉親和素的酶標(biāo)板中，于25 ℃孵育30 min，孵育完用PBS清洗1遍，每次3 min，拍干；再用PBN清洗2遍，每次3 min，拍干；隨后每孔內(nèi)加入TMB顯色液，避光顯色反應(yīng)10～15 min，拍干，在酶標(biāo)儀上讀取630 nm處的吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米金的制備與鑒定

紫外分光光度計(jì)掃描納米金在400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的最大吸收峰值，掃描結(jié)果顯示其最大吸收峰值波長(zhǎng)在520 nm處，吸光度值A(chǔ)=0.6523，呈現(xiàn)圓滑的曲線，初步證明納米金制備成功。

透射電鏡觀察納米金的形貌特征，掃描結(jié)果顯示其形狀大小均一且顆粒與顆粒之間分散均勻，沒有出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，再次證明納米金制備成功。

圖2 納米金透射電鏡圖Fig.2 Transmission electron microscopy of gold nanoparticles

2.2 金納米探針（NP）的制備

2.2.1 優(yōu)化納米金標(biāo)記DFLX多克隆抗體的pH

通過添加0.1 mol/L K2CO3來調(diào)節(jié)納米金標(biāo)記DFLX多抗的最佳pH值，由圖3可以看出當(dāng)0.1 mol/L K2CO3添加量達(dá)到9 μL時(shí)其pH變化幅度逐漸減小，因此，確定每毫升納米金標(biāo)記DFLX多抗的K2CO3添加量為9 μL。

圖3 納米金標(biāo)記多克隆抗體的最佳pH確定Fig.3 Determination of optimal pH of gold-labeled polyclonal antibodies

2.2.2 優(yōu)化納米金修飾DFLX多抗添加量

確定了納米金修飾DFLX多克隆抗體的最適pH值后，加入不同量的DFLX多克隆抗體，混勻后各管中分別加入10% NaCl溶液100 μL，靜置15 min，首先通過肉眼觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗體添加量達(dá)到20 μg/mL時(shí)，膠體金的顏色保持紅色不變，當(dāng)抗體添加量小于20 μg/mL時(shí)候，從4號(hào)管開始納米金開始發(fā)生由紅變藍(lán)的現(xiàn)象，因此，確定DFLX抗體的最少添加量為20 μg/mL，終于抗體添加量按照最少抗體添加量的20%來計(jì)算，所以，抗體的最優(yōu)添加量為24 μg/mL，并通過紫外掃描光譜來鑒定納米金標(biāo)記多抗前后其最大吸收波長(zhǎng)由520 nm處平移到527 nm處，證明納米金成功標(biāo)記上了DFLX多克隆抗體。

圖4 納米金標(biāo)記抗體蛋白最適添加量Fig.4 Optimal amount of gold-labeled antibody protein

圖5 納米金標(biāo)記DFLX多抗的紫外掃描圖Fig.5 Ultraviolet scanning of gold labeled DFLX polyclonal antibody

2.2.3 雙鏈DNA標(biāo)記DFLX多抗修飾的納米金顆粒

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)納米金復(fù)合探針標(biāo)記上DFLX多抗和雙鏈DNA以后其周圍有一層模糊的暈圈，說明在其表面連接上了一層低電子密度的物質(zhì)，證明制備成功。

圖6 雙鏈DNA標(biāo)記DFLX多抗修飾的納米金Fig.6 Double-stranded DNA labeled DFLX multi-resistant modified gold nanoparticles

2.3 MMP探針的鑒定

磁性顆粒經(jīng)過透射電鏡鑒定觀察其表面有一層清晰可見的暈圈，說明磁性顆粒表面成功標(biāo)記了單克隆抗體，即磁性探針制備成功。

圖7 磁性顆粒標(biāo)記后Fig.7 After labeling with magnetic particles

2.4 檢測(cè)探針的鑒定

圖8 檢測(cè)探針經(jīng)紫外分光光度計(jì)掃描鑒定其最大吸收峰值發(fā)生在524 nm處，與納米金最大吸收峰相比，標(biāo)記后發(fā)生了4 nm的位移，表明納米金顆粒成功標(biāo)記了巰基修飾的DNA鏈，即檢測(cè)探針制備成功。

圖8 檢測(cè)探針UV-vis掃描圖Fig.8 UV-vis scan of detection probe

圖9 檢測(cè)探針透射電鏡圖Fig.9 Transmission electron micrograph of probe

2.5 微孔板銀染雜交體系的優(yōu)化

2.5.1 鏈霉親和素包被濃度的優(yōu)化

在包被了鏈霉親和素的微孔板表面組裝生物素探針-生物條形碼-檢測(cè)探針復(fù)合物，因此其包被濃度是關(guān)鍵的影響因素。本實(shí)驗(yàn)將鏈霉親和素包被濃度稀釋成0.01、0.06、0.1、0.15、0.2 mg/kg五個(gè)濃度，檢測(cè)其濃度與吸光度值之間的關(guān)系，由圖10可以看出，鏈霉親和素的包被濃度達(dá)到0.1 mg/kg時(shí)，其吸光度值趨于穩(wěn)定，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇濃度為0.1 mg/kg為最佳包被濃度。

圖1 納米金紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet spectra of gold nanoparticles

圖10 鏈霉親和素濃度的優(yōu)化Fig.10 Optimization of Streptavidin concentration

2.5.2 生物素探針的優(yōu)化

優(yōu)化生物素探針本實(shí)驗(yàn)分別設(shè)定了0、10、20、50、100、150、200 nmol/L不同的濃度值，從圖11可以看出，當(dāng)生物素探針濃度達(dá)到100 nmol/L時(shí)，其吸光度值的變化逐漸變小，因此，選定生物素探針的最佳濃度為100 nmol/L。

圖11 生物素探針的優(yōu)化Fig.11 Optimization of biotin probe

2.5.3 檢測(cè)探針濃度的優(yōu)化

對(duì)檢測(cè)探針進(jìn)行不同濃度的稀釋0、10、20、50、80、100、150、200 nmol/L，結(jié)果見圖12，可以看出當(dāng)檢測(cè)探針濃度達(dá)到80 nmol/L的時(shí)候，其吸光度值最大，然后繼續(xù)增大檢測(cè)探針的濃度觀察發(fā)現(xiàn)吸光度值逐漸減小，因此，確定檢測(cè)探針的最優(yōu)濃度為80nmol/L。

圖12 檢測(cè)探針的優(yōu)化Fig.12 Optimization of detection probe

2.5.4 銀染時(shí)間的優(yōu)化

分別設(shè)定了0、2、5、7、9、10、11、12 min不同的銀染時(shí)間，掃描選出最佳銀染時(shí)間，結(jié)果見圖13，可以看出銀染時(shí)間在0～9 min之間檢測(cè)點(diǎn)灰度值上升速度很快，當(dāng)銀染時(shí)間達(dá)到9 min時(shí)其灰度值上升速度緩慢，因此，本實(shí)驗(yàn)最終確定最佳的銀染時(shí)間為9 min時(shí)。

圖13 銀染時(shí)間的優(yōu)化Fig.13 Optimization of silver staining time

2.5.5 該免疫方法檢測(cè)DFLX的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

建立基于微孔板銀染的生物條形碼檢測(cè)方法來測(cè)定達(dá)氟沙星的線性檢測(cè)范圍和檢出限，設(shè)定達(dá)氟沙星的濃度在0.05～50 ng/mL范圍內(nèi)，以達(dá)氟沙星濃度的對(duì)數(shù)值和抑制率為橫縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用下列公式計(jì)算抗生素IC15值，以IC15作為該方法的最低檢出限。

式中：

I——抑制率；

G max——加抗生素的濃度值；

Gmin——空白對(duì)照孔的值；

G x——抗生素濃度為x時(shí)的值。

在上述設(shè)定的范圍內(nèi)，達(dá)氟沙星濃度的log值與抑制率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，擬合其回歸方程為y=0.2432x+0.4834，R2=0.9898，根據(jù)公式計(jì)算得出IC15為3.62 ng/mL，結(jié)果顯示上述檢測(cè)方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)達(dá)氟沙星抗生素殘留的定量檢測(cè)，并且該檢測(cè)方法靈敏度較高。

圖14 該免疫分析方法的達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.14 The standard curve of the immunoassay for fluoxetine

3 討論

在包被了鏈霉親和素的微孔板內(nèi)添加納米金，而后加入銀染增強(qiáng)液，利用銀染作用放出信號(hào)，最后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)生物條形碼的含量。該技術(shù)不需要購買昂貴的儀器設(shè)備，普通實(shí)驗(yàn)室利用酶標(biāo)儀即可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物條形碼含量的檢測(cè)，這種方法的建立給一些資源有限的實(shí)驗(yàn)室提供了極大的方便，并節(jié)省了一大部分花銷。

但是該檢測(cè)方法也存在缺點(diǎn)在進(jìn)行信號(hào)放大作用時(shí)主要依賴銀染增強(qiáng)液，由于銀染增強(qiáng)液具有不穩(wěn)定性，可能會(huì)導(dǎo)致最終檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽性，使最終測(cè)得的結(jié)果不夠準(zhǔn)確。因此，該方法在大批量使用前是需要將銀染增強(qiáng)液這一不確定因素進(jìn)行充分完善后方可大量推廣應(yīng)用。

生物條形碼檢測(cè)技術(shù)可以檢測(cè)到濃度超低的物質(zhì)，具有其他檢測(cè)方法不具備的超靈敏特點(diǎn)，該技術(shù)操作起來十分簡(jiǎn)便，對(duì)操作人員的操作能力要求不高；檢測(cè)范圍面較為廣泛，只需要具備被檢物的單克隆抗體和多克隆抗體即可進(jìn)行檢測(cè)；但是該檢測(cè)技術(shù)也存在著一定的缺陷，該檢測(cè)技術(shù)跟一些核酸檢測(cè)方法相比，其檢測(cè)靈敏度是遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到的；另外，所需要的反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，試驗(yàn)成本較高；若今后把重心放在縮短整個(gè)反應(yīng)時(shí)間以及降低試驗(yàn)成本上，該檢測(cè)技術(shù)將得到更大的發(fā)展空間。

4 結(jié)論

4.1 當(dāng)抗生素含量較少時(shí)傳統(tǒng)的檢測(cè)方法通常不能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)到其含量，而生物條形碼技術(shù)檢測(cè)就可以檢測(cè)到濃度超低的物質(zhì)，其檢測(cè)靈敏度是ELISA檢測(cè)靈敏度的106倍，該技術(shù)具備操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴的儀器設(shè)備，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。

4.2 本實(shí)驗(yàn)建立的基于微孔板銀染的生物條形碼檢測(cè)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)DFLX殘留量的快速檢測(cè)，其最低檢測(cè)限為3.62 ng/mL，其檢測(cè)靈敏度是傳統(tǒng)的免疫技術(shù)的100萬倍，該方法的建立為以后檢測(cè)其他FQNs小分子物質(zhì)的殘留提供了新的技術(shù)，也為以后能制備高靈敏度的DFLX生物條形碼檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。