王逸凡，劉展志，吳敬*

1(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

在全球肥胖癥患病率快速增長的大背景下，開發(fā)天然健康稀有糖代替已有的甜味劑成為研究熱點。其中熱量低、甜度高且具有獨特生理功能的D-阿洛酮糖是當前最有競爭力的代糖之一[1-2]。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位同分異構體，具有蔗糖70%的甜度和0.3%的熱量[3]，安全性得到了美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)的認可。此外D-阿洛酮糖還具有降低血糖[2, 4]、控制體重、抗氧化[5-6]等生物活性，這也進一步使其市場需求激增。

D-阿洛酮糖在自然界中很少存在[7]，目前有化學合成法[8]和生物酶法[9]2種人工制備途徑，綠色環(huán)保、工藝簡單的酶法制備是主流方法。根據Izumoring稀有糖轉化策略，D-果糖在D-阿洛酮糖3-差向異構酶(D-psicose 3-epimerase，DPE)的催化下，C-3位置發(fā)生可逆的差向異構化反應生成D-阿洛酮糖。已經報道了來自Ruminococcussp.[10]、Clostridiumbolteae[11]、Clostridiumcellulolyticum[12]等的多種DPE，大多最適pH為弱堿性，溫度高于50 ℃時迅速失活，常溫下不宜貯存，影響其工業(yè)化應用[13]。

常用的提高蛋白質分子貯存穩(wěn)定性的方法以蛋白質分子改造、化學修飾以及添加穩(wěn)定劑3種為主。添加穩(wěn)定劑是最受相關工業(yè)產品青睞，也是最便捷的改良方法。常用添加劑[14]有:(1)酶的底物或其輔助因子[15]：一定濃度的底物與酶結合，可以維持酶的構象；(2)金屬離子[16]：特定金屬離子可以維持金屬酶的構象,有相關報道指出在Co2+存在時DPE的熱穩(wěn)定性有一定提升[17-18];(3)多元醇與糖[19]：多元醇和糖類主要通過與酶形成氫鍵來起保護作用,常用的多元醇有甘油、山梨醇、甘露醇等，常用的糖類有甘露糖、乳糖、海藻糖等;(4)具有吸附性的多聚體：通過吸附周圍環(huán)境中的水，避免蛋白質被周圍水溶液環(huán)境影響[20]。

雖然目前已有關于ClostridiumcellulolyticumDPE(CcDPE)的穩(wěn)定劑配方，但復雜繁瑣[20]。本研究同樣以CcDPE為對象，開發(fā)更高效易得的貯存穩(wěn)定劑。結果表明，僅僅添加Co2+和甘油便可以在不影響后續(xù)酶反應的前提下，將25 ℃下CcDPE半衰期延長到80 d，為提高CcDPE工業(yè)適用性提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌株為本實驗室構建保存的枯草芽孢桿菌重組菌株Bacillussubtilis/pHY300PLK-ccdpe。

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎配方上，添加20 g/L的瓊脂。

TB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉24.0，甘油5.0，胰蛋白胨12.0，K2HPO4·3H2O 16.43，KH2PO42.31。

甘油、CoCl2·6H2O、山梨醇、尼泊金甲酯、聚乙二醇-6000、海藻糖、4-羥乙基哌嗪乙磺酸{2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES}、NaCl、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、四環(huán)素，生工生物工程(上海)股份有限公司；果糖，上海麥克林生化科技有限公司；液相標準樣品D-阿洛酮糖，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 制備酶液

將本實驗室保存菌株B.subtilis/pHY300PLK-ccdpe, 以2‰的接種量接入10 mL LB(含30 mg/L四環(huán)素)中，37 ℃, 200 r/min培養(yǎng)12 h。再以5%的接種量接入TB(30 mg/L四環(huán)素抗性)培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)2 h后，轉至33 ℃，200 r/min發(fā)酵48 h。發(fā)酵結束，離心收集菌液(8 000×g,15 min,4 ℃)，棄置上清液。用一定體積的pH 7.5的20 mmol/L HEPES(0.1 mmol/L Co2+)重懸復溶。100 MPa高壓勻漿破壁，循環(huán)3次。將破壁后獲得的懸液進行離心(8 000×g, 20 min, 4 ℃)，取上清液即為DPE粗酶液。

1.2.2 DPE酶活力的測定與酶轉化

酶活力測定：在60 ℃，pH 7.5的條件下，以800 μL 100 g/L的D-果糖為底物，添加200 μL的酶液，精準反應10 min后煮沸滅酶。體系中D-阿洛酮糖和D-果糖的最終含量由HPLC測定，以產生D-阿洛酮糖的速率來表征酶活力。

酶活力單位定義：在60 ℃，pH 7.5的條件下，在單位時間(1 min)內產生1 μmolD-阿洛酮糖定義為1個酶活力單位(U)。

酶轉化方法：在60 ℃，pH 7.5的條件下，以300 g/L的D-果糖為底物，20 U/mL加酶量，反應4 h。煮沸滅酶后用HPLC方法檢測體系中D-阿洛酮糖和D-果糖含量，計算轉化率。

HPLC條件:流動相為75%乙腈;柱溫35 ℃；流速0.8 mL/min；進樣量10 μL。

1.3 貯存穩(wěn)定劑的選擇

綜合考慮成本與穩(wěn)定效果，在DPE酶液中加入糖類、醇類、金屬離子以及吸附性聚合物作為穩(wěn)定劑，比較不同穩(wěn)定劑的穩(wěn)定效果。

1.3.1 單一穩(wěn)定劑對酶穩(wěn)定性的影響

將單一的60 g/L的果糖、體積分數為20%的甘油、1 mmol/L的Co2+、20 mmol/L的山梨醇、0.3%的尼泊金甲酯、4%的聚乙二醇-6000、20 mmol/L的海藻糖等加入到酶液中，4 ℃貯存，在貯存期間每隔一段時間測定酶液中殘余酶活力。

1.3.2 復合穩(wěn)定劑

選定穩(wěn)定效果最好的2種穩(wěn)定劑進行復配，分別在4、25 ℃下保存，測定酶活力隨著時間的變化。

1.4 數據處理

每組實驗設置3個平行實驗，使用Origin 8.0軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 穩(wěn)定劑種類

不同種類穩(wěn)定劑在4 ℃下對DPE的穩(wěn)定效果如圖1所示。海藻糖、聚乙二醇-6000以及尼泊金甲酯對維持酶活力穩(wěn)定無正向效應；果糖和山梨醇對底物有一定作用，但是作用效果不顯著；Co2+和甘油對CcDPE的穩(wěn)定效果較好。

圖1 4 ℃下不同穩(wěn)定劑對于CcDPE的穩(wěn)定效果Fig.1 Effect of different stabilizers on the stability of CcDPE at 4 ℃

其中尼泊金甲酯因適宜環(huán)境偏酸性，在pH 7.5的酶液中作用效果不佳。果糖作為CcDPE發(fā)生酶反應的底物，可以與CcDPE結合形成復合物起保護作用。Co2+作為CcDPE的活性金屬離子，可以使CcDPE構象更加穩(wěn)定[16]。甘油作為常用的小分子穩(wěn)定劑，可以降低體系的極性，與蛋白質形成氫鍵，隔絕周圍的水分子環(huán)境，有助于蛋白結構穩(wěn)定[14, 19, 21]。

為了驗證穩(wěn)定劑對后續(xù)的酶轉化實驗的影響，用最終甘油體積分數為0%、10%、20%與30%的CcDPE酶液進行酶轉化。反應完全后，轉化率依次為28.75%、28.86%、28.92%與28.91%，證明甘油不會對后續(xù)的酶轉化造成影響。因此選定成本低廉的甘油和Co2+進行濃度優(yōu)化和復配。

2.2 單一穩(wěn)定劑濃度優(yōu)化

在4、25 ℃下，對單一穩(wěn)定劑Co2+、甘油的添加濃度進行優(yōu)化，不同條件下CcDPE半衰期結果如表1與表2所示。

表1 不同濃度Co2+添加下CcDPE的半衰期 單位：d

表2 不同濃度甘油添加下CcDPE的半衰期 單位：d

設定0.1、0.2、0.3、0.7、1 mmol/L的Co2+濃度梯度。4 ℃(圖2-a)下Co2+濃度對穩(wěn)定效果影響不大。25 ℃(圖2-b)下，0.2 mmol/L以上的Co2+濃度有明顯的效果，作用效果與Co2+濃度呈正相關，0.5、0.7、1 mmol/L的Co2+可以分別將酶液半衰期延長到25、38、46 d。

a-4 ℃；b-25 ℃圖2 不同濃度的Co2+對于CcDPE的穩(wěn)定效果Fig.2 Effect of different Co2+ concentrations on stability of CcDPE

對于甘油而言，設定0%、10%、20%、30%(體積分數)的濃度梯度。4 ℃(圖3-a)下，10%的甘油在前20 d對酶活力有一定程度穩(wěn)定作用，20%、30%組作用效果接近，成功將粗酶液半衰期延長到約167 d。25 ℃(圖3-b)下，30%的甘油將粗酶液半衰期成功延長至33 d，是對照組的7倍。

a-4 ℃；b-25 ℃圖3 不同濃度的甘油對于CcDPE的穩(wěn)定效果Fig.3 Effect of different glycerin concentrations on stability of CcDPE

2.3 復合穩(wěn)定劑的效果

優(yōu)化甘油與Co2+的復配穩(wěn)定劑配方，不同條件下CcDPE半衰期見表3。4 ℃下(圖4-a)放置150 d，不同組別的殘余酶活力均穩(wěn)定在70%以上，效果相差不顯著。25 ℃下，效果最好的是20%甘油與0.5 mmol/L Co2+的組合，將CcDPE粗酶液半衰期延長到80 d。

a-4 ℃；b-25 ℃圖4 復合穩(wěn)定劑對CcDPE穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of combined stabilizers on stability of CcDPE

表3 不同復合穩(wěn)定劑配方下CcDPE的半衰期 單位：d

SOENGAS等[8]發(fā)現(xiàn)含1 mmol/L Mn2+的來自Geobacillusstearothermophilus的L-阿拉伯糖異構酶在70 ℃下孵育2 h后幾乎沒有活性喪失，而無Mn2+的對照組酶的殘留活性為70%。MU等[17]發(fā)現(xiàn)Co2+對CcDPE構象有維穩(wěn)作用。張巧等[20]向CcDPE粗酶液中添加0.3%尼泊金甲酯、2 mmol/L MgSO4，6%果糖以及4%肌醇，將25 ℃下的半衰期延長到62 d；ZHANG等[22]又指出MnSO4和乙二醇能通過維持DPE構象穩(wěn)定性提高貯存穩(wěn)定性，25 ℃貯存30 d的實驗組殘余酶活力分別高出對照組17%與10%。本研究僅添加金屬離子[16]和甘油[19]便可將CcDPE于25 ℃下的半衰期延長至80 d，綠色高效，更適合后續(xù)在食品、醫(yī)療等領域的推廣。

3 結論

本研究以CcDPE為對象，通過添加Co2+和甘油，解決了工業(yè)應用中貯存穩(wěn)定性差的問題。結果顯示，4 ℃下，Co2+濃度對穩(wěn)定效果影響不大；25 ℃下，0.2 mmol/L以上的Co2+作用效果與濃度正相關，1 mmol/L的Co2+可以將粗酶液半衰期延長到46 d。4 ℃下，體積分數為20%和30%的甘油均可將CcDPE半衰期延長至167 d；25 ℃下，30%的甘油可以將半衰期延長到33 d。優(yōu)化復合穩(wěn)定劑配方，20%甘油與0.5 mmol/L Co2+組合可以將25 ℃下CcDPE的半衰期延長至80 d。研究結果為CcDPE進一步工業(yè)化應用提供了支撐。