任宏艷，康美云，王子妤，姚 琦，張璐瑤，王永韌*

1南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院整合醫(yī)學(xué)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇 南京 210023；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科，江蘇 南京 210008

樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）疫苗因其在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用而引起廣泛關(guān)注。DC 是啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答最強(qiáng)大的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞（anti?gen presenting cell，APC）。然而，DC疫苗的臨床療效往往由于缺乏能夠引起充分免疫應(yīng)答的有效抗原而受到限制［1-2］。因此，增強(qiáng)DC對(duì)抗原的加工提呈能力是促進(jìn)DC疫苗成功應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵策略。

免疫佐劑常用來(lái)與抗原結(jié)合以增強(qiáng)其免疫原性進(jìn)而誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答［3-4］。氫氧化鋁是近年來(lái)應(yīng)用最廣泛的佐劑之一。此外，由于其卓越的安全性，含鋁佐劑已被美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于臨床［3-7］。然而，經(jīng)典的含鋁佐劑只能觸發(fā)適度的體液免疫應(yīng)答，而無(wú)法誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。氫氧化鋁納米顆粒由微晶納米纖維簇組成，具有優(yōu)異的蛋白質(zhì)吸附性能［3，8］。許多研究表明，氫氧化鋁納米顆粒具有有效表面積大、生物相容性好、載抗原能力強(qiáng)等顯著優(yōu)勢(shì)［3，7-8］。我們之前的研究表明［9］，當(dāng)抗原共價(jià)結(jié)合到α?Al2O3納米顆粒時(shí)，DC對(duì)抗原的交叉提呈效率顯著提高。最近研究表明，聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）應(yīng)用于基因傳遞系統(tǒng)時(shí)，可以產(chǎn)生較高的表面電荷和膜干涉效應(yīng)，從而促進(jìn)有效的基因轉(zhuǎn)染［10-11］。本文通過(guò)PEI修飾的氫氧化鋁納米顆粒HS（HS/PEI）與抗原聯(lián)合后負(fù)載DC以探索HS/PEI是否能增強(qiáng)DC對(duì)抗原的交叉提呈誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞應(yīng)答及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6～8 周齡SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠，雌性，體重18～20 g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。6～8 周齡SPF 級(jí)OT?Ⅰ小鼠，雌性，體重18～20 g，購(gòu)自南京大學(xué)模型動(dòng)物研究中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)、使用和操作均獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。細(xì)胞株及試劑mutuDC 細(xì)胞株和B3Z細(xì)胞株由美國(guó)波特蘭腫瘤中心的胡紅明教授饋贈(zèng)。DMEM 培養(yǎng)基、RPMI?1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS（Gibco 公司，美國(guó)）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、PEI、CPRG（chlorophenol red?β?D?galactopy?ranoside）（Sigma 公司，美國(guó)）；HS（Chemtrade Chemi?cals 公司，美國(guó)）；蛋白定量檢測(cè)試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司，美國(guó)）；R848（Invivogen 公司，法國(guó)）；白介素（interleukin，IL）?12檢測(cè)試劑盒（eBio?science 公司，美國(guó)）；OVA 抗體（Santa Cruz 公司，美國(guó)）；His 標(biāo)簽蛋白純化填料Ni?Sepharose excel（GE Healthcare 公司，美國(guó)）；CFSE（carboxyfluorescein succinimidyl ester）（BioLegend公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及HS/PEI?OVA的制備

來(lái)源于CD11c：SV40LgT轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠脾臟的mutuDC細(xì)胞株在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL 鏈霉素、2 mmol/L L?谷氨酰胺的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，B3Z 細(xì)胞株（表達(dá)LacZ 的H?2Kb?OVA257?264特異性CD8+T細(xì)胞雜交瘤）在含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 鏈霉素、2 mmol/L L?谷氨酰胺的RPMI?1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將0.5 mL HS（5 mg/mL）加入1.5 mL PEI（8 000 Da，25 mg/mL）后與OVA 溶液室溫下共孵育1 h 制備成HS/PEI?OVA混合液。

1.2.2 CPRG法檢測(cè)DC對(duì)抗原的提呈能力

mutuDC 細(xì)胞（2×104個(gè)，50 μL/孔）和刺激劑［干擾素（interferon，IFN）?α、R848］作用前后的HS/PEI?OVA（10 μg/mL，50 μL/孔）混合后放入96 孔U 底培養(yǎng)板，6 h后與B3Z細(xì)胞（2×105個(gè)，100 μL/孔）37 ℃共孵育過(guò)夜。離心，取上清，200 μL PBS清洗細(xì)胞后加入CPRG工作液，37 ℃孵育4 h后加入終止液（50 μL/孔），850g離心7 min后取上清，酶標(biāo)儀595 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。B3Z 細(xì)胞特異性識(shí)別OVA 激活其中LacZ的表達(dá)，與CPRG顯色底物結(jié)合后生成氯酚紅，通過(guò)測(cè)定吸光度檢測(cè)B3Z細(xì)胞的活化情況。

1.2.3 Western blot檢測(cè)DC中泛素化OVA蛋白的表達(dá)

mutuDC（5×106個(gè)）分別與PEI?OVA、HS?OVA、HS/PEI?OVA（10 μg/mL）于37 ℃共孵育6 h后以PFO（perfringolysin O，100 ng/mL）處理30 min，離心后收集上清，蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清中的蛋白總量。按課題組之前的方法富集PFO提取液中的泛素化蛋白［12］。將帶有His6標(biāo)記的泛素化蛋白純化工具Vx3GFP融合蛋白（30 μg/mL）加入等蛋白總量的PFO提取液中，4 ℃孵育過(guò)夜。加入Ni?Sepharose excel層析柱顆粒，4 ℃旋轉(zhuǎn)混合1 h后將混合物移至層析管中進(jìn)行親和層析純化。離心后，用含5 mmol/L 咪唑的Tris?NaCl 緩 沖液（20 mmol/L Tris?Cl，300 mmol/L NaCl，pH 8.0）清洗樹(shù)脂，最后用含250 mmol/L 咪唑的Tris?NaCl緩沖液洗脫his6?Vx3GFP結(jié)合的泛素化蛋白。洗脫液在4 ℃下以PBS 透析過(guò)夜，將富集的泛素化蛋白保存在-80 ℃。通過(guò)Western blot檢測(cè)其中泛素化OVA 蛋白的含量。將富集的泛素化蛋白經(jīng)SDS?PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，加入OVA抗體4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3 次后加入HRP 標(biāo)記的二抗室溫下孵育1 h，TBST 洗膜3 次后加化學(xué)發(fā)光試劑，在暗室中采用凝膠成像分析儀進(jìn)行分析。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)DC負(fù)載HS/PEI?OVA后培養(yǎng)上清中IL?12的表達(dá)

mutuDC 細(xì)胞（2×104個(gè)，50 μL/孔）和刺激劑（IFN?α、R848）作用前后的HS/PEI?OVA（10 μg/mL，50 μL/孔）混合后放入96孔U底培養(yǎng)板37 ℃孵育6 h后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清。ELISA 法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL?12的表達(dá)。

1.2.5 CFSE標(biāo)記的OT?ⅠT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取OT?Ⅰ小鼠脾臟細(xì)胞加入CFSE染料（終濃度10 μmol/L），37 ℃孵育10 min，加入5 倍體積的預(yù)冷PBS，冰上放置5 min，低溫離心10 min 后以RPMI?1640培養(yǎng)液重懸至4×106個(gè)/mL；2×105個(gè)DC分別與PEI?OVA、HS?OVA、HS/PEI?OVA（10 μg/mL）于37 ℃共孵育6 h后與上述CFSE標(biāo)記好的OT?Ⅰ小鼠脾臟細(xì)胞（4×106個(gè)）混合37 ℃共孵育5 d，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CFSE標(biāo)記的OT?ⅠT細(xì)胞的增殖。

1.2.6 HS/PEI?OVA 免疫后小鼠體內(nèi)CD8+IFN?γ+T細(xì)胞比率及特異性T細(xì)胞分泌IFN?γ的檢測(cè)

C57BL/6小鼠左下側(cè)腹部下注射接種B16?OVA細(xì)胞（2×105個(gè)/100 μL）。待移植瘤生長(zhǎng)的第7天，移植瘤有米粒大小時(shí)，隨機(jī)分組，每組5只，兩側(cè)腹股溝淋巴結(jié)注射OVA、HS?OVA、HS/PEI?OVA（每側(cè)15 μg/15 μL），以PBS 作為對(duì)照組；第12天尾靜脈注射DC?OVA、DC?HS?OVA、DC?HS/PEI?OVA 疫苗（每只5×106個(gè)/500 μL），對(duì)照組注射DC?PBS（每只5×106個(gè)/500 μL）。第16天，取小鼠脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞，含10%胎牛血清的RPMI?1640重懸細(xì)胞后放入48孔板（每孔2×106個(gè)/mL），每孔加SIINFEKL（1 μg/mL，OVA257?264peptide）或CD3抗體（5 μg/mL）再刺激12 h后，每孔加50 ng/mL 佛波酯、500 ng/mL 鈣離子載體和2 μmol/L 高爾基體抑制劑繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收獲細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+IFN?γ+T 細(xì)胞比率；刺激72 h后，收取培養(yǎng)上清，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN?γ的水平。CD3抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組定量資料比較采用單因素方差分析（one?way ANO?VA）檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用LSD 法。兩組定量數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HS/PEI 顯著增強(qiáng)mutuDC對(duì)OVA 蛋白的抗原提呈作用

為了驗(yàn)證HS/PEI 在DC 抗原提呈中的作用，將不同濃度（0.001、0.003、0.010、0.030、0.100、0.300、1.000、3.000、10.000、30.000、100.000、300.00 μg/mL）的PEI、HS、HS/PEI 分別與OVA 蛋白（10 μg/mL）室溫共孵育1 h，mutuDC 負(fù)載PEI?OVA、HS?OVA、HS/PEI?OVA 后與B3Z 細(xì)胞37 ℃孵育過(guò)夜，CPRG 法檢測(cè)DC對(duì)抗原的提呈能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著納米顆粒濃度上升，與PEI?OVA、HS?OVA組相比，HS/PEI?OVA組的吸光值顯著上升（圖1A、B）。并且當(dāng)納米顆粒濃度為3 μg/mL 時(shí)，mutuDC 負(fù)載HS/PEI?OVA對(duì)B3Z細(xì)胞的激活已顯著高于其他組（圖1B），故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，OVA蛋白濃度皆為10 μg/mL，納米顆粒濃度皆為3 μg/mL。提示HS/PEI 可顯著增強(qiáng)mutuDC對(duì)OVA抗原的提呈能力。

圖1 CPRG法檢測(cè)DC分別負(fù)載PEI?OVA、HS?OVA、HS/PEI?OVA后對(duì)OVA的提呈能力Figure 1 The efficiency of OVA cross?presentation by DCs loaded with PEI?OVA，HS?OVA or HS/PEI?OVA was deter?mined by CPRG assay

為了探討HS/PEI 增強(qiáng)DC 抗原提呈作用的機(jī)制，mutuDC 與PEI?OVA、HS?OVA、HS/PEI?OVA 于37 ℃共孵育6 h 后加入PFO 處理DC。課題組以往研究已證實(shí)泛素化蛋白能增強(qiáng)DC的交叉提呈刺激特異性T細(xì)胞活化［12］。因此我們運(yùn)用泛素化蛋白純化工具Vx3GFP 融合蛋白從上述PFO 處理的DC 上清液中富集泛素化蛋白，Western blot檢測(cè)其中泛素化OVA 蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，DC 負(fù)載HS/PEI?OVA 后泛素化OVA 蛋白的表達(dá)明顯高于PEI?OVA和HS?OVA組（圖2A）。

成熟的DC 分泌多種細(xì)胞因子，其中IL?12可通過(guò)促進(jìn)交叉提呈誘導(dǎo)有效的T細(xì)胞應(yīng)答［13-14］。為進(jìn)一步探討HS/PEI?OVA刺激對(duì)DC分泌IL?12的影響，將mutuDC 分別與PEI?OVA、HS?OVA、HS/PEI?OVA于37 ℃共孵育6 h后收取上清，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL?12的表達(dá)。結(jié)果顯示，HS/PEI?OVA 刺激DC分泌IL?12的水平明顯高于其他兩組（圖2B）。

圖2 HS/PEI增強(qiáng)DC抗原提呈能力及IL?12的分泌Figure 2 Enhanced cross?presentation and secretion of IL?12 in DCs by HS/PEI

以上結(jié)果提示PEI修飾的經(jīng)典納米鋁佐劑可顯著增強(qiáng)DC對(duì)抗原的交叉提呈，誘導(dǎo)有效的T細(xì)胞應(yīng)答。

2.2 IFN?α和TLR 刺激劑R848對(duì)DC 提呈HS/PEI?OVA的影響

TLR 和I?IFN 可調(diào)節(jié)DC 的成熟、抗原提呈及其誘導(dǎo)的抗病毒和抗腫瘤反應(yīng)［15-17］。為檢測(cè)TLR和I?IFN對(duì)DC提呈HS/PEI?OVA的影響，mutuDC負(fù)載刺激劑（IFN?α、R848）作用前后的HS/PEI?OVA 于37 ℃孵育6 h后收取上清，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL?12的表達(dá)；與B3Z細(xì)胞37 ℃孵育過(guò)夜后，CPRG法檢測(cè)DC對(duì)HS/PEI?OVA 的提呈能力。結(jié)果顯示，與未刺激的HS/PEI?OVA組相比，IFN?α和R848 刺激組DC分泌IL?12的水平顯著升高（圖3A），且能進(jìn)一步刺激B3Z 細(xì)胞的活化（圖3B）。提示IFN?α、R848可進(jìn)一步增強(qiáng)DC對(duì)HS/PEI?OVA的交叉提呈，誘導(dǎo)高效的T細(xì)胞應(yīng)答。

圖3 IFN?α和TLR 刺激劑R848對(duì)DC 提呈HS/PEI?OVA的影響Figure 3 Cross?presentation of HS/PEI?OVA by DCs can be enhanced by IFN?α and TLR agonist R848

2.3 DC負(fù)載HS/PEI?OVA后顯著促進(jìn)OT?ⅠT細(xì)胞的增殖

DC 將抗原加工處理提呈給T 細(xì)胞在刺激T 細(xì)胞活化的同時(shí)也會(huì)促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖。OT?Ⅰ轉(zhuǎn)基因小鼠CD8+T細(xì)胞的T細(xì)胞受體（TCR）特異性識(shí)別H?2Kb?OVA257-264。將DC 負(fù)載PEI?OVA、HS?OVA、HS/PEI?OVA后與CFSE標(biāo)記的OT?Ⅰ小鼠脾臟細(xì)胞37 ℃共孵育5 d，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)OT?ⅠT細(xì)胞的增殖。結(jié)果顯示，DC 負(fù)載HS/PEI?OVA 誘導(dǎo)OT?ⅠT細(xì)胞的增殖（80.1%）明顯高于PEI?OVA組（27.0%）和HS?OVA組（43.3%）（圖4）。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)HS/PEI 能顯著增強(qiáng)DC 交叉提呈抗原誘導(dǎo)特異性T 細(xì)胞免疫應(yīng)答。

圖4 DC負(fù)載HS/PEI?OVA后顯著促進(jìn)OT?ⅠT細(xì)胞的增殖Figure 4 The proliferation of OT?I T cells induced by DCs loaded with HS/PEI?OVA

2.4 DC?HS/PEI?OVA 疫苗顯著增強(qiáng)小鼠體內(nèi)CD8+IFN?γ+T細(xì)胞比率及特異性T細(xì)胞IFN?γ的分泌

為了觀察DC?HS/PEI?OVA疫苗誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)T細(xì)胞活化的情況，我們建立小鼠B16?OVA黑色素瘤模型，第7 天分別給予OVA、HS?OVA 或HS/PEI?OVA 淋巴結(jié)初次免疫，第12 天DC?OVA、DC?HS?OVA 或DC?HS/PEI?OVA 尾靜脈加強(qiáng)免疫（圖5A）。第16天，取小鼠脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞，用SIINFEKL或CD3抗體再刺激12 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+IFN?γ+T 細(xì)胞比率。結(jié)果顯示，HS/PEI?OVA 免疫組的淋巴細(xì)胞在體外通過(guò)SIINFEKL 刺激后CD8+IFN?γ+T細(xì)胞比率明顯高于OVA組、HS?OVA組和PBS對(duì)照組（圖5B）。72 h 后，ELISA 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN?γ水平。結(jié)果顯示，與PBS 和OVA組相比，HS?OVA免疫組的IFN?γ水平有一定程度的升高；而HS/PEI?OVA免疫組IFN?γ水平增高更顯著（圖5C）。以上結(jié)果提示HS/PEI在體內(nèi)可顯著增強(qiáng)DC對(duì)抗原的交叉提呈誘導(dǎo)有效的T細(xì)胞應(yīng)答。

圖5 DC?HS/PEI?OVA免疫B16?OVA荷瘤小鼠后顯著增強(qiáng)小鼠體內(nèi)CD8+IFN?γ+T細(xì)胞比率及特異性T細(xì)胞IFN?γ的分泌Figure 5 Vaccination with DC?HS/PEI?OVA significantly increased the percentage of CD8+IFN?γ+T cells and IFN?γ secre?tion of specific T cells in the B16?OVA tumor?bearing mice

3 討論

一直以來(lái)鋁佐劑作為免疫增強(qiáng)劑被廣泛應(yīng)用于疫苗［3-7］。經(jīng)典的含鋁佐劑只能增強(qiáng)抗體反應(yīng)，而不能誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答［18］。已有研究證實(shí)，氫氧化鋁納米顆粒具有很強(qiáng)的吸附能力，可以攜帶可溶性蛋白［3，8］。PEI由于攜帶強(qiáng)正電荷在修飾納米顆粒時(shí)可增強(qiáng)其表面電荷［10］。本研究以O(shè)VA 作為模型抗原，以O(shè)VA 特異性CD8+T 細(xì)胞雜交瘤B3Z 為效應(yīng)細(xì)胞，CPRG法檢測(cè)B3Z細(xì)胞的活化。我們發(fā)現(xiàn)低濃度的OVA（10 μg/mL）與HS/PEI 混合后即可以引起較強(qiáng)的B3Z反應(yīng)，提示PEI修飾的常規(guī)鋁佐劑顆?？梢燥@著提高DC抗原交叉提呈的效率。

DC 中高濃度的抗原蛋白是誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。本課題組已經(jīng)證實(shí)，與細(xì)胞裂解液相比，泛素化蛋白能誘導(dǎo)更高效抗原交叉提呈［12］。Sims等［19］報(bào)道了一種可以結(jié)合泛素化蛋白的工具蛋白Vx3，本課題組前期構(gòu)建的Vx3GFP工具蛋白已成功分離腫瘤細(xì)胞中的泛素化蛋白［12］。膜孔形成蛋白PFO 可以穿透細(xì)胞膜并釋放胞漿蛋白到培養(yǎng)基中［20］。因此，本研究通過(guò)Western blot 檢測(cè)了PFO 處理的DC胞漿中Vx3GFP 分離的泛素化抗原蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)OVA 與HS/PEI 結(jié)合后，DC 細(xì)胞內(nèi)釋放的Ub?OVA 明顯增加。成熟DC 分泌的Th1 型細(xì)胞因子IL?12 已證實(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）應(yīng)答［13-14］。通過(guò)檢測(cè)DC 負(fù)載OVA 聯(lián)合納米顆粒后分泌IL?12 的變化，我們發(fā)現(xiàn)DC 負(fù)載HS/PEI?OVA后分泌IL?12明顯增加。表明HS/PEI可通過(guò)增加DC 中泛素化蛋白的表達(dá)及IL?12 的分泌誘導(dǎo)高效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

已證實(shí)IFN?α/β能有效誘導(dǎo)DC的成熟，增強(qiáng)DC對(duì)抗原的交叉提呈從而激活CD8+T 細(xì)胞［16-17］。DC表達(dá)多種TLR，TLR的激活是DC實(shí)現(xiàn)有效交叉提呈的關(guān)鍵信號(hào)［21］。TLR7/8 激活劑R848、TLR7 激動(dòng)劑Imiquimod刺激DC可顯著上調(diào)DC表面MHC Ⅱ類(lèi)分子和共刺激分子CD40、CD80、CD86的表達(dá)，并增加IFN?α的分泌［22-25］。本研究結(jié)果也證實(shí)了IFN?α和R848 刺激可進(jìn)一步促進(jìn)HS/PEI 增強(qiáng)DC 交叉提呈的作用。其他TLR刺激物Poly（I：C）、CpG、LPS等對(duì)HS/PEI增強(qiáng)DC交叉提呈的作用還有待進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步探討HS/PEI 能否在小鼠體內(nèi)增強(qiáng)DC對(duì)OVA抗原的交叉提呈進(jìn)而誘導(dǎo)特異性CD8+T細(xì)胞活化，我們用OVA、HS?OVA 或HS/PEI?OVA 負(fù)載DC 后免疫B16?OVA 荷瘤小鼠，取出小鼠脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞后用SIINFEKL 再刺激，發(fā)現(xiàn)HS/PEI?OVA 免疫組CD8+IFN?γ+T 細(xì)胞的比率明顯增加，比其他組產(chǎn)生更高水平的IFN?γ。這些結(jié)果證明了HS/PEI在體內(nèi)能顯著增強(qiáng)DC交叉提呈抗原進(jìn)而誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。

抗原的高效提呈是誘導(dǎo)有效T細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。本研究證明了PEI修飾的氫氧化鋁納米顆粒（HS/PEI）能顯著增強(qiáng)DC 抗原提呈作用誘導(dǎo)高效的T 細(xì)胞應(yīng)答。更重要的是，我們進(jìn)一步證明了HS/PEI聯(lián)合抗原后能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性的免疫應(yīng)答。DC負(fù)載HS/PEI聯(lián)合抗原后在抗腫瘤免疫應(yīng)答方面的作用還需進(jìn)一步研究。