張碧艷 楊苗 金曉峰

子宮內(nèi)膜癌作為高發(fā)性、病因未明性婦科惡性腫瘤，多見于圍絕經(jīng)期、絕經(jīng)后婦女，伴陰道排液、腹部包塊、出血及疼痛等臨床表現(xiàn)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，隨著社會(huì)快速發(fā)展，人們經(jīng)濟(jì)條件改善，生活方式改變，子宮內(nèi)膜癌患病率逐年增高，對(duì)女性生命健康存在嚴(yán)重危害［1］。目前，臨床針對(duì)子宮內(nèi)膜癌形成、進(jìn)展機(jī)制仍未闡明，但隨著分子生物學(xué)、基因組織學(xué)深入研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 存在抑癌基因、調(diào)控癌基因作用，于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組織內(nèi)表達(dá)異常，能對(duì)癌細(xì)胞增殖、凋亡進(jìn)行調(diào)控［2］。而miR-34a 作為miRNA 家族重要成員，與多種腫瘤的細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)，參與腫瘤細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化及凋亡過程［3］。本研究對(duì)miR-34a 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，探討其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 材料 選擇2018 年4 月至2020 年3 月本院手術(shù)切除獲得的子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本30 例、癌旁子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本30 例，均由病理科醫(yī)師通過嚴(yán)格的病理實(shí)驗(yàn)鑒定、確診?；颊哂谛g(shù)前均未行全身治療，手術(shù)切除組織樣本后立即置入液氮環(huán)境下凍存。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批，患者知情并簽署同意書。

1.2 方法（1）細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 ①細(xì)胞培養(yǎng)：經(jīng)RPMI 1640 培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清）開展人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa 培養(yǎng)，在37 ℃的二氧化碳（濃度5%）培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每間隔2 d 對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行更換，若細(xì)胞匯合>80%開展傳代培養(yǎng)。②細(xì)胞轉(zhuǎn)染：于轉(zhuǎn)染前1 d，將Ishikawa 細(xì)胞準(zhǔn)確接種在6 孔板內(nèi)，選擇無抗生素的無菌培養(yǎng)基實(shí)施細(xì)胞培養(yǎng)；在細(xì)胞密度顯示為70%～80%情況下，依據(jù)Lipofectamine 2000 試劑盒的說明書實(shí)施細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染6 h 后將6 孔板中培養(yǎng)基取出，并加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清。再于37℃的二氧化碳（濃度5%）培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng)。（2）熒光定量PCR 法檢測(cè)miR-34a 表達(dá) 對(duì)總RNA 進(jìn)行提取，經(jīng)熒光定量PCR 法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組織、癌旁細(xì)胞組織內(nèi)miR-34a 表達(dá)，嚴(yán)格按說明書實(shí)施操作。（3）MTT 法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力 經(jīng)MTT法（四唑鹽比色法）對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，即選擇轉(zhuǎn)染后人子宮內(nèi)膜癌的Ishikawa 細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶開展消化離心處理，將5×103個(gè)細(xì)胞準(zhǔn)確接種在96 孔板內(nèi)，設(shè)定每孔為200l，于37℃的二氧化碳（濃度5%）培養(yǎng)箱內(nèi)行3～4 h 培養(yǎng)，后于每孔內(nèi)加入DMSO（150l），充分振蕩5～10 min，使晶體充分溶解，并在酶標(biāo)儀的490 nm 處對(duì)光密度進(jìn)行測(cè)定，繪制MTT 檢測(cè)曲線圖。（4）基因分析 經(jīng)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)miR-34a 和Notch1-3'UTR 間產(chǎn)生的堿基互補(bǔ)關(guān)系進(jìn)行在線預(yù)測(cè)；并經(jīng)點(diǎn)突變對(duì)Notch1-3'UTR 的3'UTR MUT（突變型載體）實(shí)施構(gòu)建，再將miR-34a mimics、miR-34a 對(duì)照物miRNC、Notch1-3'UTR MUT（突變型載體）及MT（野生型載體）分別轉(zhuǎn)染進(jìn)Ishikawa 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h 后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集，并依據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定試劑盒說明書實(shí)施操作，對(duì)細(xì)胞內(nèi)螢火蟲的熒光素酶、海腎熒光素酶相關(guān)活性進(jìn)行檢測(cè)。（5）流式細(xì)胞儀測(cè)定子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡 即選擇轉(zhuǎn)染后人子宮內(nèi)膜癌的Ishikawa 細(xì)胞，取0.25%胰酶開展消化離心處理，于37℃的二氧化碳（濃度5%）培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，行12h 細(xì)胞同步化處理后，將原培養(yǎng)液更換，并開展相應(yīng)處理，在24h 后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集，行離心洗滌處理后，依據(jù)試劑盒說明書將流式緩沖液重懸細(xì)胞加入，并加入Annexin Ⅴ-TITC（5l）混勻，于4℃避光環(huán)境下孵育20～30 min，后加入PI 染液（5l），再孵育5 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況，激發(fā)波長為488 nm，設(shè)定發(fā)射波長為530 nm，補(bǔ)償調(diào)節(jié)熒光后設(shè)置十字門。將Q2+Q4 區(qū)域細(xì)胞比值代表細(xì)胞凋亡率。（6）Western-blot 法測(cè)定蛋白表達(dá) 對(duì)轉(zhuǎn)染后人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，處理后將蛋白裂解液加入并對(duì)細(xì)胞蛋白樣品進(jìn)行收集，定量后將等量蛋白樣品開展SDS-PAGE 電泳分離及轉(zhuǎn)膜處理，經(jīng)5%脫脂奶粉行60 min 封閉，并加入稀釋一抗，于室溫下孵育60 min，再經(jīng)PBS 溶液洗滌，后加入適量化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色處理，對(duì)成像進(jìn)行拍照，并經(jīng)相應(yīng)軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，以χ2校驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組織內(nèi)miR-34a 表達(dá) 經(jīng)熒光定量PCR 分析發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組織內(nèi)miR-34a 表達(dá)量明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 癌旁組織和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組織內(nèi)miR-34a

2.2 miR-34a 靶基因測(cè)定結(jié)果 經(jīng)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)miR-34a 和Notch1-3'UTR 間產(chǎn)生的堿基互補(bǔ)關(guān)系進(jìn)行在線預(yù)測(cè)結(jié)果，見圖2?；蚍治霭l(fā)現(xiàn)，相較于miRNC 和WT 共 轉(zhuǎn) 染，miR-34a mimics 和Notch1-3'UTR WT 共轉(zhuǎn)染的熒光強(qiáng)度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；但miR-34a mimics 和Notch1-3'UTR MUT 共轉(zhuǎn)染熒光強(qiáng)度，與miR-NC 和MUT 共轉(zhuǎn)染熒光強(qiáng)度對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖3。

圖2 靶基因的生物信息學(xué)技術(shù)在線預(yù)測(cè)結(jié)果

圖3 雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定miR-34a靶基因結(jié)果

2.3 細(xì)胞活力 經(jīng)MTT 法分析，與miR-NC組比較，miR-34a mimics組細(xì)胞培養(yǎng)1 d、2 d、3 d 后活力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與miR-34a mimics組比較，miR-34a mimics 聯(lián)合Notch1組的細(xì)胞活力明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

圖4 miR-34a干擾子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞活力結(jié)果

2.4 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡結(jié)果 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，相較于miR-NC組，miR-34a mimics組的細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；相較于miR-34a mimics組，miR-34a mimics 聯(lián)合Notch1組的細(xì)胞凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖5。

圖5 miR-34a 干擾子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡結(jié)果

2.5 Ishikawa細(xì)胞內(nèi)Notch1表達(dá) 經(jīng)Western-blot法分析發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組比較，miR-34a mimics組Ishikawa細(xì)胞內(nèi)Notch1 表達(dá)明顯下降，但PARP 降解產(chǎn)物表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與miR-34a mimics組比較，miR-34a mimics 聯(lián)合Notch1組Ishikawa細(xì)胞內(nèi)Notch1 表達(dá)明顯升高，但PARP 降解產(chǎn)物表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；見圖6。

圖6 miR-34a影響子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞內(nèi)Notch1表達(dá)結(jié)果

3 討論

近年來，隨著子宮內(nèi)膜癌致癌機(jī)制的深入探索，以及分子生物學(xué)研究的發(fā)展，針對(duì)子宮內(nèi)膜癌早期診斷、分型、治療、預(yù)后等的認(rèn)知不斷進(jìn)步。其中，各種細(xì)胞蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常及基因突變已被證實(shí)與子宮內(nèi)膜癌的形成、發(fā)展密切相關(guān)。與此同時(shí)，子宮內(nèi)膜癌的形成和發(fā)展是由多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及基因異常相互作用，從而形成的一個(gè)復(fù)雜連鎖的基因蛋白反應(yīng)過程。miR-34a 作為高度保守miRNA，于哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布，存在組織特異性，于肺以外組織內(nèi)廣泛分布。研究顯示，miR-34a 存在抑癌作用，能抑制肝癌、乳腺癌等相關(guān)腫瘤，故認(rèn)為miR-34a 能明顯影響子宮內(nèi)膜癌［4-5］。

本研究結(jié)果顯示，相較于癌旁組織，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組織內(nèi)miR-34a 表達(dá)下降。miR-34a 對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組織增殖明顯抑制，并加快細(xì)胞凋亡［6］。研究表明，miR-205 作為miRNA 家族中最為重要的成員之一，于卵巢癌細(xì)胞組織內(nèi)呈高表達(dá)，和腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性［7-8］。故抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是臨床治療腫瘤的關(guān)鍵［9］。

大量體外研究顯示，化療藥物可對(duì)癌細(xì)胞凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。近年來，隨著臨床深入研究癌細(xì)胞增殖、凋亡發(fā)現(xiàn)，miR-34a 經(jīng)對(duì)凋亡通路有關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10］。本研究顯示，miR-34a 過度表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組織凋亡存在促進(jìn)作用，提示miR-34a 過度表達(dá)可增加細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白-PARP 降解產(chǎn)物表達(dá)，明確miR-34a 可將細(xì)胞凋亡通路激活，加快子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組織凋亡。研究指出，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路較多，Notch1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要由CSLD-NA 結(jié)合蛋白、Notch 受體及Notch 配體構(gòu)成，參與細(xì)胞增殖、分化活動(dòng)，能對(duì)細(xì)胞分化及增殖、凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞生理及病理過程［11］。大量研究表明，Notch 信號(hào)存在促腫瘤作用，腫瘤細(xì)胞組織內(nèi)Notch 表達(dá)明顯高于正常組織，和腫瘤增殖、凋亡關(guān)聯(lián)密切［12］。本研究經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定實(shí)驗(yàn)明確miR-34a可結(jié)合Notch1 3'UTR，對(duì)Notch 啟動(dòng)子活性進(jìn)行影響。同時(shí)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，miR-34a 可對(duì)Notch1 蛋白表達(dá)進(jìn)行抑制，提示Notch1 為miR-34a 下游靶基因。而MTT、流式細(xì)胞凋亡測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Notch1 表達(dá)過度可對(duì)miR-34a 介導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)行抑制，促進(jìn)細(xì)胞增殖；提示miR-34a 調(diào)控子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞增殖、凋亡，主要經(jīng)干擾靶基因Notch1 蛋白表達(dá)［13］。分析miR-34a對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控作用，可能與Notch 通路存在相關(guān)性，能為臨床早期診治子宮內(nèi)膜癌提供理論依據(jù)、臨床試驗(yàn)基礎(chǔ)。但針對(duì)Notch1 蛋白對(duì)Ishikawa 細(xì)胞增殖、凋亡的影響機(jī)制仍需進(jìn)一步明確，有待深入研究Notch1 蛋白和細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白PARP 降解產(chǎn)物間互相作用，為臨床防治子宮內(nèi)膜癌提供新選擇［14］。

綜上所述，Notch1 為miR-34a 重要的下游靶基因，miR-34a 經(jīng)對(duì)Notch1 表達(dá)進(jìn)行靶向調(diào)控，能對(duì)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞的凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)，進(jìn)而阻斷Ishikawa細(xì)胞增殖。