王潘紅 鄭明 蔡云峰

小細(xì)胞肺癌（SCLC）是肺癌的一種特殊類型，約占所有肺癌的15%，相比于其他類型，SCLC 易出現(xiàn)侵襲性發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，危害性較大［1］。SCLC 主要發(fā)生在吸煙人群中，由于吸煙人口逐年增多以及吸煙人口低齡化等情況，SCLC 的發(fā)病率每年都有所增長［2］。植物中提取的大黃素（EM）具有較高的藥用性［3］，有研究發(fā)現(xiàn)，大黃素對小鼠肝癌、淋巴肉癌、黑色素瘤和肺癌等均有較高抑制作用，可作為一種新型的抗癌藥物。紫杉醇（TAXOL）是一種從植物紅豆杉的樹皮中所提取的天然有效成分，具有較好的抗腫瘤活性，在臨床上已經(jīng)用于多種癌癥的治療［4］，但在SCLC 治療中的應(yīng)用較少，有學(xué)者指出，紫杉醇與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用會(huì)有更好的治療效果［5-6］。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立SCLC裸鼠模型，探討紫杉醇聯(lián)合大黃素對模型裸鼠TTF-1、CD56、ProGRP 的影響，旨在為肺癌的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/ c-nu 裸鼠購自北京動(dòng)物模型庫。裸鼠4～6 個(gè)月齡，體質(zhì)量20～24 g，在（21±2）℃、40%～70%的濕度和12 h 的光/暗循環(huán)環(huán)境下飼養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 儀器與試劑 大黃素（批號(hào)：wkq16071004，純度>98%）購自四川維克奇生物公司；紫杉醇（批號(hào)：130416-12，純度>98%）購自西昌市凱源康藥業(yè)公司；HE 染色液購自美國Origene；TTF-1、CD56、Pro-GRP抗體購自美國Sigma 公司；免疫組化試劑盒購自Abcam（中國）公司；NF05DH-1831 型血?dú)夥治鰞x購自廣州華西科創(chuàng)科技有限公司；iTube 3000 全自動(dòng)發(fā)光免疫分析儀購自煙臺(tái)艾德康生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 通過脛骨結(jié)節(jié)骨髓腔注射方法構(gòu)建SCLC 裸鼠模型［7］。將成功建模的裸鼠分為3組，分別為模型組、TAXOL組和TAXOL+EM組，每組各20 只，另選20 只健康裸鼠為空白組。其中TAXOL組裸鼠給藥60 mg/mL 紫杉醇，TAXOL+EM組裸鼠給藥30 mg/mL紫杉醇+30 mg/mL 大黃素，空白組和實(shí)驗(yàn)組用同種方法給予等量的溶劑，共給藥14 d。

1.4 動(dòng)脈氧分壓（PaO2）檢測 分別于給藥第1、7、14 天采集大鼠動(dòng)脈血0.2 mL，采用血?dú)夥治鰞x按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行檢測PaO2。

1.5 肺、肝組織HE 染色觀察 各組小鼠折頸處死，取其肺部組織。肺組織用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定、脫水、包埋、切片，然后對切片脫蠟和HE 染色，在光鏡下（×400）觀察組織病理形態(tài)。取裸鼠肝組織，操作同上述步驟，觀察SCLC 肝轉(zhuǎn)移的情況。

1.6 免疫組化檢測TTF-1、CD56 水平 肺組織經(jīng)切片、二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、抗原修復(fù)。后加入一抗（1 ∶200），4℃過夜，PBS 洗3 次。加入生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h。DAB 顯色液染色。蘇木素染核，酒精脫水，二甲苯透明30 min，中性樹膠封片，于倒置顯微鏡100 倍視野下觀察是否陽性。

1.7 CLIA 法檢測ProGRP 水平 取各組裸鼠外周血，按照全自動(dòng)發(fā)光免疫分析儀機(jī)器說明書操作，檢測裸鼠血清中ProGRP 的水平。

1.8 RT-PCR 法檢測TTF-1、CD56、ProGRP 的mRNA水平 取出大鼠肺組織，用Trizol 法裂解并提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在冰上準(zhǔn)備50 μL PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：2XSYBR25 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水20.7 μL，TaqDNAPolymerase0.3 μL。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，45 個(gè)循環(huán)，95℃10 s，65℃60 s，97 ℃1 s。記錄各孔Ct 值，以β-actin 作內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計(jì)算各mRNA 的相對表達(dá)量，計(jì)算公式為：ΔΔCT=ΔCt 實(shí)驗(yàn)-ΔCt 空白，其中ΔCt=Ct 目的-Ct內(nèi)參。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物序列表（5'→3'）

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD 檢驗(yàn)，計(jì)量資料用卡方檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間PaO2比較 模型組，TAXOL組和TAXOL+EM組在1 d、7 d及14 d PaO2水平均低于空白組（P<0.05）；TAXOL組和TAXOL+EM組PaO2水平隨著持續(xù)給藥而升高，且均高于模型組（P<0.05）；TAXOL+EM組各時(shí)間點(diǎn)PaO2水平均高于TAXOL組（P<0.05），見表2。

表2 不同時(shí)間段各組PaO2比較［mmHg，（）］

表2 不同時(shí)間段各組PaO2比較［mmHg，（）］

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與TAXOL組比較，△P<0.05

2.2 肺組織染色結(jié)果比較 與空白組比較，其他組裸鼠肺組織明顯發(fā)生病變，肺泡間隙變??；與模型組比較，TAXOL組和TAXOL+EM組肺部組織病變情況有所緩解；與TAXOL組比較，TAXOL+EM組肺組織恢復(fù)情況更好，見圖1。

圖1 各組肺組織HE染色情況

2.3 各組肝轉(zhuǎn)移結(jié)果比較 與空白組比較，其他組裸鼠肝組織出現(xiàn)結(jié)節(jié)，病理染色結(jié)果與肺組織結(jié)果相似，提示肺癌細(xì)胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移；與模型組比較，TAXOL組和TAXOL+EM組肝組織轉(zhuǎn)移程度有所減輕；與TAXOL組比較，TAXOL+EM組肝組織情況更好。見圖2。

圖2 各組肝組織HE染色情況

2.4 各組TTF-1、CD56、ProGRP 水平比較 見表3。

表3 各組TTF-1、CD56、ProGRP水平比較

2.5 各組TTF-1、CD56、ProGRP 的mRNA 水平比較 見表4。

表4 各組TTF-1、CD56、ProGRP的mRNA水平比較（）

表4 各組TTF-1、CD56、ProGRP的mRNA水平比較（）

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與TAXOL組比較，△P<0.05

3 討論

SCLC 是神經(jīng)內(nèi)分泌型肺癌的一種，相比于其他類型的肺癌具有更高的侵襲能力。SCLC 由于其高增殖、轉(zhuǎn)移快等特點(diǎn)，易復(fù)發(fā)和和惡化，是一類危害較大的惡性腫瘤［8］。SCLC 單純通過手術(shù)切除治療療效欠佳，臨床上通常聯(lián)合使用化療或放療方法［9］。

紫杉醇是多種癌癥化療的常用藥物，受到廣泛的關(guān)注和研究。紫杉醇通過結(jié)合微管蛋白抑制其聚解，導(dǎo)致其排列異常并阻斷腫瘤細(xì)胞正常的有絲分裂紡錘體發(fā)育和隨后的細(xì)胞分裂達(dá)到抗腫瘤效果［10］。同時(shí)由于腫瘤細(xì)胞的抗藥性等原因，單一使用紫杉醇治療的手段急需改進(jìn)。紫杉醇聯(lián)合其他藥物被認(rèn)為可以有效增強(qiáng)其功效。劉曉潔等通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇聯(lián)用紫杉醇可以通過增加P-gp 蛋白的表達(dá)，有效促進(jìn)食管癌EC109 細(xì)胞的凋亡［11］；TOMOYUKI 等［12］研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇聯(lián)合雷公藤治療晚期胃癌患者具有更高的的療效和安全性。盧娜等研究指出，姜黃素聯(lián)合多西紫杉醇對人肺癌細(xì)胞放療增敏機(jī)制與腫瘤細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，且在紫杉醇濃度為60 mg/mL時(shí)效果最好［13］。大黃素是天然的生物抑制劑，近年來作為抗癌藥物被廣泛研究。何敏等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘆薈、大黃素聯(lián)用順鉑可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的凋亡［8］。

TTF-1 是NKX2 家族的一種轉(zhuǎn)錄基因核蛋白，常在肺組織和甲狀腺組織及其癌變過程出現(xiàn)、表達(dá)，影響多種基因調(diào)控，>90%原發(fā)性SCLC 表達(dá)陽性TTF-1［14］。CD56 是一種跨膜神經(jīng)細(xì)胞糖蛋白黏附分子，是肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤首選的特異性標(biāo)志物［15］。PROGRP 是腦腸激素的一種，是SCLC 增殖因子胃泌素釋放肽的前體，可作為SCLC 特異性腫瘤標(biāo)志物［16］。

本研究結(jié)果顯示，紫杉醇與大黃素聯(lián)用可以有效降低裸鼠TTF-1、CD56、ProGRP 水平，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，且效果比單一使用紫杉醇更好，這與上述研究結(jié)果相似。同時(shí)，隨著給藥時(shí)間的延長，單一使用紫杉醇的小鼠PaO2上升水平減緩，而紫杉醇和大黃素聯(lián)用給藥的小鼠PaO2持續(xù)上升，提示紫杉醇與大黃素聯(lián)用的抗腫瘤效果不僅優(yōu)于同濃度的紫杉醇，且可能在一定程度上能克服腫瘤細(xì)胞的抗藥性，從而達(dá)到持續(xù)抑制的效果。

綜上所述，大黃素可以增強(qiáng)紫杉醇對SCLC 裸鼠TTF-1、CD56 及ProGRP 的影響，降低TTF-1、CD56及ProGRP 表達(dá)水平，有效抑制SCLC，同時(shí)可以在一定程度上減少腫瘤細(xì)胞的抗藥性，達(dá)到持續(xù)抑制的效果，為SCLC 的治療提供新的科學(xué)思路。