牟娟，劉芳，王興潔，劉愛平，敖曉琳,2，李建龍，劉書亮,2*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安， 625014)2(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品加工與安全研究所，四川 雅安， 625014)

食醋作為一種酸性調(diào)味品和防腐劑在世界范圍內(nèi)被普遍使用。中國傳統(tǒng)釀造食醋多以固態(tài)發(fā)酵為主，其工藝復(fù)雜且發(fā)酵處于開放環(huán)境，由復(fù)雜微生物菌群共同作用代謝產(chǎn)生眾多風(fēng)味物質(zhì)，使食醋具有一定的營養(yǎng)和獨特的風(fēng)味。由于傳統(tǒng)食醋釀造的開放式環(huán)境，食醋發(fā)酵、轉(zhuǎn)運、暫存、陳釀及包裝過程管理不善，易導(dǎo)致食醋成品發(fā)生微生物污染[1]。污染的部分微生物能在食醋中生長代謝引起食醋變質(zhì)，主要表現(xiàn)為脹氣、產(chǎn)膜、發(fā)黏、返渾及沉淀增多等現(xiàn)象[2]，其中脹氣主要表現(xiàn)為塑料袋(瓶)醋出現(xiàn)鼓包(瓶)現(xiàn)象，玻瓶醋開瓶時發(fā)生較大的爆破音甚至出現(xiàn)瓶炸裂現(xiàn)象，夏季尤為嚴重。這些變質(zhì)現(xiàn)象不僅影響食醋的感官、口感、體態(tài)及品質(zhì)，也極大降低了食醋的營養(yǎng)及應(yīng)用價值，給食醋產(chǎn)業(yè)帶來了較大的困擾。目前引起食醋脹氣的微生物分為可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物[3-4]，這類污染微生物及其對食醋的影響尚未明晰。采用高通量測序技術(shù)(highthroughput sequencing technology)對脹氣變質(zhì)食醋的微生物基因序列進行分析，能夠快速鑒定脹氣變質(zhì)食醋中微生物的種屬和豐度[5]。本文主要對脹氣變質(zhì)食醋和正常食醋的理化指標和感官指標進行測定，再結(jié)合高通量測序技術(shù)，了解引起食醋脹氣的細菌多樣性，從而為食醋產(chǎn)業(yè)中脹氣問題的解決提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

不同批次脹氣變質(zhì)食醋成品樣品(B1～B8)、生醋(C1～C4)、發(fā)酵醋醅(P1～P6)、正常食醋成品樣品(Z1～Z6)均采集于四川某麩醋廠。脹氣食醋高倍稀釋液樣品：采用脹氣變質(zhì)醋液進行10倍遞增稀釋，取稀釋液接種于4°～5°無菌醋液培養(yǎng)至醋液產(chǎn)氣，選取最高稀釋液接種能引起脹氣的培養(yǎng)醋液，編號B9～B14。

1.1.2 主要試劑

NaOH、HCl、CuSO4、ZnSO4、鄰苯二甲酸氫鉀、亞甲基藍指示劑、酒石酸鉀鈉、冰乙酸、亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6]、葡萄糖、甲醛溶液(均為AR級)，均購于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

乙腈、甲醇(HPLC級)，瑞典Oceanpak公司；乳酸、乙酸標準品(純度≥99.5%)，天津市光復(fù)精細化工研究所；丙酮酸(純度≥99.5%)，北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

PCA培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH(7.0±0.2)，121 ℃滅菌15 min。用于菌落總數(shù)計數(shù)。

虎紅培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，瓊脂20.0 g，1/3 000孟加拉紅溶液100 mL，蒸餾水900 mL，氯霉素0.1 g，121 ℃滅菌15 min。用于霉菌酵母菌計數(shù)。

醋酸菌培養(yǎng)基：酵母粉10.0 g，葡萄糖10.0 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂20.0 g，121 ℃滅菌20 min，使用前添加30 mL無水乙醇。用于醋酸菌計數(shù)。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，K2HPO42.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，CH3COONa 5.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1 mL，MgSO40.58 g，MnSO40.25 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。用于乳酸菌計數(shù)。

1.1.4 儀器與設(shè)備

顯微鏡，日本OLYMPUS公司；LC-10A2010C HT液相色譜儀，日本Shimazu公司；Agilent 7890A-5979C氣相色譜質(zhì)譜儀，美國Agilent有限公司；My CyclerTM Thermal Cycler PCR儀，美國Bio-Rad公司；MINI-SUB CELL.GT電泳儀，美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋的感官指標對比評價

分別取相同酸度的脹氣變質(zhì)食醋和正常食醋樣品，對體態(tài)、色澤、黏度、渾濁度、沉淀量以及氣味進行評價[6]。

1.2.2 脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋理化指標的對比分析

4°～5° 無菌醋液：將6°左右原醋液與蒸餾水按體積比2∶1混合后，115 ℃滅菌20 min。

樣品處理：取40 mL脹氣變質(zhì)醋樣離心得菌體沉淀，用4 mL無菌的4°～5° 醋液重懸沉淀，按接種量2%接入490 mL無菌4°～5° 醋液中混勻。將接種的混合醋液分裝于2個塑料軟瓶中，1瓶置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至脹氣(為脹氣變質(zhì)后食醋)，另1瓶置于4 ℃冰箱中冷藏(為脹氣變質(zhì)前食醋或正常食醋)，實驗設(shè)3個重復(fù)[7]。

pH測定：采用pH計測定。

總酸含量測定：參考GB/T 5009.41—2003[8]。

氨基酸態(tài)氮含量測定：參考GB 5009.235—2016[9]。

還原糖含量測定：參考GB 5009.7—2016[10]。

總糖含量測定：亞鐵氰化鉀滴定法[11]。

1.2.3 脹氣變質(zhì)食醋和正常食醋的有機酸含量測定

樣品前處理：取10 mL醋樣分別加入K4Fe(CN)6(質(zhì)量濃度為106 g/L)溶液和ZnSO4(質(zhì)量濃度為300 g/L)溶液各2 mL，用水定容至100 mL，靜置30 min，用0.22 μm水相微孔濾膜過濾，再經(jīng)C18固相萃取小柱過濾，收集5 mL濾液供HPLC檢測，每個樣品重復(fù)測定3次。配制有機酸標準混合液，根據(jù)峰面積繪制標曲，HPLC條件參考文獻[12]。

1.2.4 脹氣變質(zhì)食醋和正常食醋的揮發(fā)性物質(zhì)含量測定

樣品處理及GC-MS條件參考文獻[13]。

數(shù)據(jù)處理：由NIST檢索譜庫，選擇揮發(fā)性成分匹配度>80%的化合物，再根據(jù)峰面積歸一化來計算各化合物的相對含量(%)。

1.2.5 脹氣變質(zhì)食醋沉淀物鏡檢及脹氣變質(zhì)食醋微生物計數(shù)

取1 mL脹氣醋樣10 000 r/min離心1 min后得菌體，用200 μL無菌生理鹽水重懸菌體，然后革蘭氏染色鏡檢觀察菌體形態(tài)并照相[7]。

選擇不同批次脹氣變質(zhì)食醋樣品，用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，取100、10-1的樣品稀釋液1 mL于培養(yǎng)皿，傾注PCA培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基、醋酸菌培養(yǎng)基及MRS培養(yǎng)基，置于適宜條件下培養(yǎng)一定時間進行平板計數(shù)，每個稀釋度做2個平行。其中PCA平板于(30±1) ℃培養(yǎng)(48±2) h；虎紅平板于(28±1) ℃培養(yǎng)5 d；醋酸菌平板于(30±1) ℃培養(yǎng)(48±2) h；MRS平板于(36±1) ℃厭氧培養(yǎng)(72±2) h。

1.2.6 脹氣變質(zhì)食醋細菌多樣性分析

對測試樣品提取細菌總DNA，采用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌基因組16S rDNA的V4區(qū)進行擴增。使用Illumina公司建庫試劑盒構(gòu)建文庫，對獲得的高通量測序數(shù)據(jù)進行過濾和拼接，之后選取97%以上的序列作OTU聚類分析。最后使用QIME、Mothur和R等軟件對樣本進行細菌群落結(jié)構(gòu)及物種差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋的感官評價結(jié)果

色澤與風(fēng)味是衡量食醋品質(zhì)的重要指標。食醋發(fā)酵過程由于微生物生長代謝作用，產(chǎn)生酸類、酯類、醇類、羰基化合物、酚類物質(zhì)以及乙酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸及蘋果酸等非揮發(fā)性酸和揮發(fā)性酸，這些物質(zhì)共同賦予了食醋豐富的滋味[14]。優(yōu)質(zhì)食醋的色澤呈現(xiàn)黑褐色或透亮的紅棕色，其色澤主要是由釀醋過程中還原糖和氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)形成[14]。對脹氣食醋與正常食醋的感官指標比較分析發(fā)現(xiàn)(表1)，正常食醋液體清亮且呈紅棕色，醋香醇厚。而脹氣食醋發(fā)生明顯的產(chǎn)氣現(xiàn)象，顏色變深，搖動后出現(xiàn)渾濁，液體流動性變差，醋香弱且有淡腐臭味，瓶底明顯可見大量泥狀沉淀。因此，引起食醋產(chǎn)氣(脹氣)的微生物，可能由于其菌體自身繁殖及其代謝產(chǎn)物造成食醋產(chǎn)氣、渾濁及沉淀等現(xiàn)象[15-16]。

表1 脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋感官品質(zhì)的差異Table 1 Sensory evaluation of swollen vinegar and normal vinegar

2.2 脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋理化指標的對比分析

食醋中污染微生物能利用食醋的營養(yǎng)成分進行生長和代謝，將還原糖2次發(fā)酵生成乳酸和乙酸，導(dǎo)致食醋糖類物質(zhì)減少、總酸含量升高[17]。由表2可知，根據(jù)6批次脹氣食醋與正常食醋的平均值比較，脹氣食醋pH降低約0.05～0.10，說明引起食醋脹氣變質(zhì)的污染微生物能夠適應(yīng)低pH環(huán)境且可以保持生長繁殖。脹氣食醋總酸含量比正常食醋平均增加約為10%，孫文麗等[18]分析脹氣食醋的總酸含量比正常食醋高0.5倍，說明脹氣變質(zhì)食醋的總酸含量增高。而總糖和還原糖分別約降低50%和60%，且由理化指標間的相關(guān)性分析可知(表3)，總酸和還原糖之間具有一定相關(guān)性，其總酸-還原糖相關(guān)系數(shù)為0.596，顯著性系數(shù)為0.069。

表2 脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋的理化指標比較結(jié)果Table 2 Physical-chemical properties of swollen vinegar and normal vinegar

表3 理化指標間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of the physical-chemical properties

2.3 脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋的有機酸含量差異

有機酸種類與含量對食醋的酸味品質(zhì)具有較大影響。脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋的有機酸含量結(jié)果如圖1所示，空白對照組不接種脹氣變質(zhì)食醋的菌體沉淀，其在37 ℃培養(yǎng)和4 ℃存放的結(jié)果一致，所測指標沒有變化。所測6個不同批次的食醋發(fā)生脹氣變質(zhì)后，乳酸和乙酸含量分別平均升高約500、180 mg/100mL。脹氣食醋的乳酸含量達2 000 mg/100mL，一方面是由于四川麩醋中乳酸含量高于乙酸[19]，另一方面是由于食醋中污染微生物通過多種代謝途徑產(chǎn)生乳酸。而丙酮酸的含量顯著減少，其機制是由于丙酮酸在生物代謝過程中作為重要的中間轉(zhuǎn)換物質(zhì)，在污染微生物產(chǎn)生的乳酸脫氫酶作用下被轉(zhuǎn)化生成乳酸，在乙酸脫氫酶作用下被轉(zhuǎn)化生成乙酰輔酶A，進而生成乙醇和乙酸，表明食醋脹氣污染微生物能夠?qū)⒈岽x生成乳酸和乙酸。

圖1 脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋中有機酸含量變化Fig.1 Variation of organic acid content in swollen vinegar and normal vinegar注：*表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋的揮發(fā)性物質(zhì)差異

對6組脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋樣本采用固相微萃取結(jié)合GC-MS測定其揮發(fā)性成分，同時使用SIMCA 14軟件分析風(fēng)味主成分。由圖2-A可知，脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋有明顯的分布區(qū)間距離，說明食醋脹氣變質(zhì)前后的揮發(fā)性成分組成有較大的差別。由圖2-B可知，脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋的差異揮發(fā)性成分主要為乙酸、糠醛和糠醇。由圖3可知，脹氣變質(zhì)食醋中乙酸含量比正常食醋中增加約10%，糠醇含量明顯增加，增量約為5%(是正常食醋的2倍)，而糠醛顯著性降低，減少量約為35%。當(dāng)食醋中糠醇含量為8 mg/L以上時，則產(chǎn)生令人不悅的異味，導(dǎo)致食醋風(fēng)味變差，這與感官評價結(jié)果一致[20]。KOOPMAN等[21]以CupriavidusbasilensisHMF14為研究對象，發(fā)現(xiàn)在醛還原酶和醇脫氫酶的作用下，糠醛能與糠醇互相轉(zhuǎn)化，與此同時糠醛在醛氧化酶的作用下可以轉(zhuǎn)化為糠酸，而該代謝途徑存在于不同微生物中，例如乳酸菌[22]。由此推測脹氣食醋中污染微生物也能通過醛還原酶將糠醛轉(zhuǎn)化生成糠醇。此外，脹氣食醋中苯甲醛含量稍有減少，苯甲醛具有杏仁味和焦糖味，是麩醋中含量最豐富的醛類物質(zhì)[23]。這些主要揮發(fā)性物質(zhì)的變化共同影響著食醋的風(fēng)味。

A-主成分分析圖；B-主成分圖圖2 脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋主成分分析圖和主成分圖Fig.2 Principal component analysis diagram and principal component diagram of swollen vinegar and normal vinegar

圖3 脹氣變質(zhì)食醋與正常食醋中部分揮發(fā)性成分含量變化Fig.3 Variation of volatile components in swollen vinegar and normal vinegar

2.5 脹氣變質(zhì)食醋菌體沉淀鏡檢及微生物計數(shù)結(jié)果

圖4為隨機抽取3批次脹氣食醋的沉淀鏡檢結(jié)果，均為細菌形態(tài)，革蘭氏染色陽性(G+)，桿狀、單個排列，可初步判定食醋脹氣污染微生物為G+桿狀細菌。根據(jù)國家標準方法對6批次脹氣食醋中菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、乳酸菌數(shù)及醋酸菌數(shù)進行檢測，所測脹氣食醋樣品均未檢出相關(guān)菌落，這與馬凈麗等[24]研究結(jié)果一致。因此推斷引起食醋脹氣的這類微生物不能被國標規(guī)定方法檢出。也正是由于該類污染微生物在食醋生產(chǎn)中不能被檢出，在運輸和售賣過程中由于受到搖晃、光照及溫度的影響，使污染微生物在醋液中大量滋生，致使食醋出現(xiàn)脹袋(瓶)、泡沫及沉淀增多等現(xiàn)象。

圖4 脹氣食醋鏡檢結(jié)果(10×100)Fig.4 The microscopic examination from swollen vinegar(10×100)

2.6 脹氣變質(zhì)食醋細菌多樣性分析

運用高通量測序技術(shù)對脹氣食醋污染細菌菌群、醋醅與生醋細菌菌群進行解析，科水平細菌群落結(jié)果如圖5所示，所有樣本中科水平上共計15種類群，其中乳桿菌科(Lactobacillaceae)在所有樣本中相對豐度最高且占比為85%。其次是醋酸桿菌科(Acetobacteraceae)，主要集中在樣本P1、P4和C1，所占比例分別為2.28%、13.42%和3.33%，與醋醅及生醋中存在大量醋酸菌的結(jié)論一致。而其他科水平的細菌占比均較少，推測引起食醋變質(zhì)脹氣的細菌多為乳桿菌科。

采用聚類分析來探索所有樣本中的不同細菌，圖6為占屬水平最高的前10個屬的豐度熱圖。所測樣本的乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度最高，在樣本B7、B12、B13中含量均高于97%。其次是未分類的乳桿菌屬(unclassifiedLactobacillus)，在B3和B11樣本中豐度約為50%，占比相對較高。此外，醋酸桿菌屬(Acetobacter)豐度主要集中在醋醅P4中，為12%，其他醋醅及生醋樣品中豐度略低，而其在部分產(chǎn)氣醋樣B1、B3和B8中的豐度較低，可能與食醋帶有一些醋酸桿菌屬死菌體有關(guān)。綜上可知，在測試樣本中屬水平豐度最高的是Lactobacillus和unclassifiedLactobacillus兩個屬，表明引起食醋脹氣變質(zhì)的細菌主要為乳桿菌屬細菌，且存在于發(fā)酵醋醅及生醋中，在食醋生產(chǎn)后工序過程中可能發(fā)生2次污染導(dǎo)致該類細菌進入包裝醋產(chǎn)品中，進而在適宜溫度條件下生長導(dǎo)致食醋脹氣變質(zhì)。這與ENTANI等[25]及翟磊等[26]于脹氣變質(zhì)食醋源分離獲得耐酸乳桿菌屬于乳桿菌屬的結(jié)果一致。在已有報道中，通常采用平板法和高通量測序?qū)γ洑馐炒字械奈⑸镞M行鑒定，研究表明引起食醋脹氣的微生物主要有Lactobacillus、芽孢桿菌屬(Bacillus)、甲烷球菌屬(Methanococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)及鐵丸球菌(Ferroglobus)[18,27-28]，其中普遍存在的優(yōu)勢細菌有Lactobacillus和Bacillus細菌，其在脹氣變質(zhì)食醋中數(shù)量分別增長了35倍和100倍[28]。這些細菌對酸或熱有抗性，加之目前食醋后處理工藝設(shè)施設(shè)備相對較差，因此在食醋釀造及后處理中較難防控2次污染或殺滅脹氣菌[29]。由于本實驗測試的脹氣變質(zhì)食醋中細菌并不能通過常規(guī)微生物培養(yǎng)方法檢出，包括采用MRS平板無乳酸菌菌落檢出，結(jié)合高通量測序結(jié)果推測這類乳桿菌屬細菌為不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)微生物，與現(xiàn)有報道存在較大差異，今后有必要進行深入研究。

圖5 科水平柱狀圖Fig.5 Mcrobial community bartplot on family level

圖6 10個最高豐度細菌屬水平熱圖Fig.6 The heatmap of the 10 highest abundance bacteria genera

3 結(jié)論

通過比較脹氣食醋與正常食醋理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)脹氣食醋的pH降低、總酸含量增加、總糖和還原糖含量降低；乳酸和乙酸含量升高，而丙酮酸含量明顯降低。分析食醋揮發(fā)性成分發(fā)現(xiàn)，脹氣變質(zhì)食醋中的乙酸和糠醇含量升高，而糠醛苯甲醛含量降低。微生物指標檢驗結(jié)果為脹氣食醋中存在大量G+桿菌，而這些細菌不能通過常規(guī)培養(yǎng)方法檢出，說明引起食醋脹氣的微生物可能為不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)微生物。此外，基于Illumina MiSeq對脹氣變質(zhì)食醋、高倍稀釋液樣品、醋醅及生醋中細菌16S rDNA的高通量測序分析，表明所有測試樣品豐度最高的細菌為Lactobacillus和unclassifiedLactobacillus，推斷引起食醋產(chǎn)氣變質(zhì)的優(yōu)勢細菌為乳桿菌屬，其可能為不可培養(yǎng)或難培養(yǎng)微生物，并存在于醋醅及生醋中，食醋產(chǎn)品受到其2次污染導(dǎo)致脹氣變質(zhì)。本研究揭示了脹氣變質(zhì)食醋的理化性質(zhì)及污染微生物種類，為食醋產(chǎn)業(yè)脹氣變質(zhì)菌的防控提供了理論依據(jù)。