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微小RNA-381在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)及對卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響*

2021-11-04 05:35徐潔歡鄧玉屏李耀軍
現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生 2021年20期
關(guān)鍵詞:小室卵巢癌引物

徐潔歡,鄧玉屏,李耀軍

(1.長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院護(hù)理學(xué)院,湖南 長沙 410600;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院,湖南 長沙 410013)

卵巢惡性腫瘤致死性很高[1]。卵巢癌患者發(fā)病隱匿,早期臨床癥狀不明顯,并且尚無可靠的早期檢測方法,多數(shù)卵巢癌患者初診時已經(jīng)為腫瘤晚期。據(jù)統(tǒng)計其5年生存率僅為30%~45%[2]。微小RNA(miRNA)作為癌基因或抑癌基因調(diào)控著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3],其屬于內(nèi)源性非編碼小分子RNA。其中微小RNA-381(miR-381)屬于腫瘤抑制miRNA[4-5]。目前,關(guān)于miR-381在卵巢癌中表達(dá)的研究很少見[6]。本研究探討了miR-381在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá),以及對卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,對找尋新的卵巢癌腫瘤特異性診斷標(biāo)記物和基因治療新靶點(diǎn)具有一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1材料 卵巢癌細(xì)胞A2780、SKOV3購自普拉特澤生物科技有限公司細(xì)胞庫。miR-381 mimics NC、miR-381 mimics、miR-381 inhibitor NC、miR-381 inhibitor均購自吉瑪公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自上海恪敏生物科技有限公司;QIAzol裂解試劑、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自百賽生物,其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純,CCK-8購自MCE,二甲基亞砜購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染分組 將卵巢癌細(xì)胞A2780、SKOV3分別置于10%胎牛血清、無血清杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基和1%雙抗的RPMI 1640 高糖完全培養(yǎng)液(美國Gibco公司)中培養(yǎng)。取對數(shù)期細(xì)胞,接種于6孔板每孔(3.0×105個/孔)。當(dāng)達(dá)到80%融合,根據(jù)Lipofectamine 2000說明書對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分為miR-381control組(不轉(zhuǎn)染miR-381控制)、miR-381 mimics NC組(miR-381模擬陰性對照)、miR-381 mimics組(轉(zhuǎn)染miR-381模擬)、miR-381 inhibitor NC組(miR-381抑制陰性對照)和miR-381 inhibitor組(miR-381抑制)。

1.2.2實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測miR-381的表達(dá) 收集細(xì)胞,采用TrizoL法進(jìn)行qRT-PCR。U6作為內(nèi)參,使用 方法計算。miR-381-3p上游引物序列為5′-CCAGUGCA CCGACCCUUGAG ACUGC-3′,miR-381-3p下游引物序列為5′-AGCCUAAACUCGGUCCAA GCAUC-3′;U6的上游引物序列為5′-CTCGCTTCG GCAGCACA-3′,U6的下游引物序列為5′-AACGC TTCACGAATTT GCGT-3′。

1.2.3CCK-8實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24 h后將重懸后的細(xì)胞于96 孔板接種,等待貼壁后再分別于0、12、24、48、72 h每孔加10 μL CCK-8溶液,于37 ℃培養(yǎng)箱下孵育3 h。采用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀測定各孔光密度(OD)值。

1.2.4劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 采用劃痕檢測卵巢癌細(xì)胞A2780、SKOV3轉(zhuǎn)染miR-381后的遷移情況。將A2780、SKOV3細(xì)胞接種于6孔板中,并將細(xì)胞置于無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓12 h。每孔中線處以100 μL的移液器槍頭劃過,再每孔加入2 mL無血清DMEM培養(yǎng)基,經(jīng)過48 h培養(yǎng)后在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。

1.2.5Transwell侵襲小室 在Transwell小室上層接種1×105個細(xì)胞,并在Transwell小室下層加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基,再置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h后拭去Transwell小室多余基質(zhì)膠并去除上室細(xì)胞,再以生理鹽水洗2次。然后采用結(jié)晶紫染色液進(jìn)行染色,用生理鹽水洗2次,在顯微鏡下拍照并計算結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1miR-381在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá) 經(jīng)慢病毒感染miR-381過表達(dá)的卵巢癌A2780、SKOV3 細(xì)胞能使細(xì)胞內(nèi)miR-381表達(dá)明顯上調(diào)。見圖1。

圖1 卵巢癌細(xì)胞miR-381表達(dá)

2.2miR-381對卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響 轉(zhuǎn)染了miR-381 mimics的A2780、SKOV3卵巢癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了mimics NC的A2780、SKOV3卵巢癌細(xì)胞比較,48、72 h細(xì)胞活性均較低,轉(zhuǎn)染了miR-381 inhibitor的A2780、SKOV3卵巢癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了inhibitor NC的A2780、SKOV3卵巢癌細(xì)胞比較,48、72 h細(xì)胞活性均較高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明miR-381的過表達(dá)使A2780、SKOV3卵巢癌細(xì)胞活性降低,miR-381抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖能力。見表1、圖2。

表1 miR-381對A2780、SKOV3卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.3miR-381對細(xì)胞卵巢癌遷移和侵襲能力的影響 轉(zhuǎn)染了miR-381 mimic的A2780、SKOV3卵巢癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了miR-381 mimic NC的A2780、SKOV3卵巢癌細(xì)胞比較,48 h后劃痕距離較大,愈合率小[分別為(35.0±2.1)%、(63±5.0)%],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);轉(zhuǎn)染了miR-381 inhibitor的A2780、SKOV3卵巢癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了inhibitor NC的A2780、SKOV3卵巢癌細(xì)胞比較,48 h后的劃痕距離較小,愈合率大[分別為(55.0±1.0)%、(49.0±1.0)%],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明miR-381使卵巢癌細(xì)胞A2780、SKOV3遷移速度減慢,抑制卵巢癌細(xì)胞的迀移能力。miR-381 mimics組穿入Matrugel基質(zhì)膠的卵巢癌細(xì)胞A2780、SKOV3的灰度值均明顯低于miR-381control組及miR-381 inhibitor組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);miR-381control組與miR-381 inhibitor組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明卵巢癌細(xì)胞miR-381的表達(dá)水平可影響細(xì)胞侵襲能力。見圖3、4。

圖4 侵襲檢測結(jié)果

3 討 論

相關(guān)研究表明,miRNA在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的特異性在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后等過程中均起著重要作用。卵巢癌相關(guān)miRNA作為疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物或腫瘤抑制劑的創(chuàng)新用途對卵巢癌患者而言可能是有前途的診治工具,使得miRNA在卵巢癌中生物學(xué)功能的研究和闡述顯得尤其重要。

miR-381為miRNA中的一種,其編碼序列位于14號染色體上,已證實(shí)與細(xì)胞增殖、分化有關(guān)。陳兵海[7]分析驗(yàn)證了miR-381、miR-424與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族1的直接靶向關(guān)系。林成輝等[8]探討了血清miR-381在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá),結(jié)果顯示,血清miR-381在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者中的相對表達(dá)水平明顯降低。卞干霞[9]研究表明,卵巢癌組織miR-381-3p表達(dá)水平降低可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖。楊澤波等[10]研究表明,食管癌組織miR-381呈低表達(dá)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),miR-381-3p在乳頭狀甲狀腺癌中的表達(dá)異常下調(diào),可能與乳頭狀甲狀腺癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[11-13]。

本研究結(jié)果顯示,miR-381在卵巢癌細(xì)胞A2780、SKOV3低表達(dá),表明miR-381可能在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用。將miR-381轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞A2780、SKOV3發(fā)現(xiàn),miR-381過表達(dá)后卵巢癌A2780、SKOV3細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力受到了抑制。進(jìn)一步證實(shí)了miR-381在卵巢癌中可能擔(dān)當(dāng)著重要的抑癌基因角色。miR-381可能成為卵巢癌生物治療的重要靶點(diǎn)之一,為今后卵巢癌的生物治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。李丹[14]研究表明,miR-381在卵巢癌中低表達(dá),上調(diào)miR-381可能通過抑制肝臟受體同源物-1、基質(zhì)金屬蛋白酶2表達(dá)而抑制卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。但是否存在其他使miR-381發(fā)揮抑癌因子作用的通路及具體機(jī)制仍需進(jìn)行全面深入的研究[15-19]。

卵巢癌化療耐藥是治療卵巢癌效果不佳的原因之一。已有學(xué)者對miRNA在耐藥形成機(jī)制中的作用進(jìn)行了深入探索,指出在對化療敏感和耐藥細(xì)胞系及組織之間存在明顯不同的miRNAs表達(dá)譜[20]。有研究表明,miRNA與多種腫瘤的多藥耐藥相關(guān),但miR-381與卵巢癌耐藥相關(guān)研究尚不多見,需進(jìn)一步進(jìn)行miR-381與卵巢癌耐藥相關(guān)研究,為尋找卵巢癌新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

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