張俊英,朱吉風(fēng),江建霞,楊立勇,蔣美艷,李延莉,王偉榮,周熙榮

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所,上海 201403)

油菜(Brassica napusL.)是我國重要的油料作物,也是產(chǎn)油效率較高的油料作物之一[1-2]。利用雜種優(yōu)勢(shì)是提高油菜產(chǎn)量的有效途經(jīng),優(yōu)良的油菜雜種組合,通常能夠增產(chǎn)20%—30%[3-4]?，F(xiàn)階段我國油菜雜交種的種植面積已經(jīng)超過50%,雜種優(yōu)勢(shì)在甘藍(lán)型油菜育種中具有重要地位[5]。

不同來源的甘藍(lán)型油菜顯性核不育材料的遺傳基礎(chǔ)存在一定差異。如宜3A及其衍生系是通過2對(duì)顯性基因Ms與Rf互作控制,其中Ms為顯性不育基因,Rf為顯性上位基因,能抑制Ms不育基因的表達(dá),從而恢復(fù)可育[6-8]。中國發(fā)明專利ZL89109310.9公開了利用上述遺傳模式設(shè)計(jì)的甘藍(lán)型油菜核雄性不育三系制種方案,用甘藍(lán)型油菜純合兩型系中的不育株與臨保系生產(chǎn)全不育系,全不育系與恢復(fù)系生產(chǎn)雜交種。但是,三系雜交制種是一項(xiàng)長期的工程,臨保系與恢復(fù)系的純度會(huì)在一定程度上影響到所生產(chǎn)雜交種的純度。遺傳分析表明:宜3A衍生系609AB和Rs1046AB中存在一對(duì)受復(fù)等位基因控制的遺傳模型,即Ms是顯性雄性的不育位點(diǎn),Mf是Ms的等位顯性抑制位點(diǎn),ms是正?？捎稽c(diǎn),它們的顯隱性關(guān)系體現(xiàn)為Mf>Ms>ms[9-10]。有研究采用BnMS5來描述該基因,指出Rs1046AB的復(fù)等位基因遺傳模式如下:BnMS5b為顯性不育基因,BnMS5a為恢復(fù)基因,能夠恢復(fù)BnMS5b導(dǎo)致的不育表型,BnMS5c為正常可育基因,它們的顯隱性關(guān)系為BnMS5a>BnMS5b>BnMS5c[11-13]。

由于顯性核不育雜交種都屬于臨保系,雜交種中可能混雜有恢復(fù)系。采用合適的鑒定方法區(qū)分雜交種中的臨保系和恢復(fù)系,有利于雜交種純度的鑒定。目前,大田形態(tài)學(xué)標(biāo)記鑒定和生化標(biāo)記鑒定是比較傳統(tǒng)的雜交種鑒定方法,形態(tài)學(xué)標(biāo)記鑒定雖然簡(jiǎn)單、快速、易于觀察,但是易受環(huán)境條件和人為因素的影響[14-15]。生化標(biāo)記鑒定與形態(tài)學(xué)標(biāo)記鑒定相比,更為豐富,容易操作,但是多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目少,標(biāo)記不具有共顯性,這兩種方法很難區(qū)分親緣關(guān)系較近的雜交種[16-17]。因此,顯性核不育雜交種純度的鑒定已成為育種生產(chǎn)上亟待解決的重要問題[18]。

在分子標(biāo)記方法快速發(fā)展的背景下,對(duì)于雜交種及其純度,采用分子標(biāo)記方法進(jìn)行鑒定,相對(duì)于傳統(tǒng)的鑒定方法有著非常大的優(yōu)越性。目前,普遍采用的分子標(biāo)記法有SNP[19]、CAPS[20]、SRAP[21]、SSR[22]、RAPD[23]、AFLP[24]等。SNP分子標(biāo)記是在SSR標(biāo)記之后的第三代分子標(biāo)記,具有數(shù)量多、分布廣泛、遺傳穩(wěn)定性等特征,受到科研工作者的關(guān)注。近年來SNP分子標(biāo)記被普遍應(yīng)用于黃瓜[25]、甜瓜[26]、菜豆[27]、甜椒[28-29]等蔬菜品種的分子鑒定。

目前,甘藍(lán)型油菜顯性核不育分子標(biāo)記研究都集中在BnMS5b(不育基因)和BnMS5a(恢復(fù)基因)之間,而沒有涉及到BnMS5a(恢復(fù)基因)和BnMS5c(臨?；?之間,因此恢復(fù)系和臨保系的鑒別仍依賴傳統(tǒng)的測(cè)交鑒定法,周期較長。本研究擬開發(fā)能有效用于區(qū)分恢復(fù)系和臨保系的分子標(biāo)記,旨在利用該分子標(biāo)記鑒定顯性核不育油菜雜交種純度,為油菜雜交種純度鑒定提供一條簡(jiǎn)捷有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。其中3008和3012分別為甘藍(lán)型油菜顯性核不育臨保系和恢復(fù)系,與純合兩型系4078AB內(nèi)可育株配置雜交組合,分別從每個(gè)雜交F1代中提取DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。顯性核不育雜交品種‘核雜17號(hào)’用于雜交種純度鑒定。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

通過對(duì)甘藍(lán)型油菜A8和A5染色體已知序列片段與顯性核不育恢復(fù)基因BnMS5a和臨?；駼nMS5c序列比對(duì),確定SNP位點(diǎn),設(shè)計(jì)SNP擴(kuò)增引物(圖1)。正向引物為SEF:5’-TCAAAGGTTTAAGGCTTTCG-3’,其中,第20位的堿基T為SNP位點(diǎn)。反向引物為SER:5’-TGTAAAGGTTGAGCCTTTTG-3’,其中,第23位的堿基T為SNP位點(diǎn)。利用設(shè)計(jì)的SNP擴(kuò)增引物,分別對(duì)甘藍(lán)型油菜顯性核不育恢復(fù)系和臨保系材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

圖1 SEF和SER引物的設(shè)計(jì)Fig.1 Design of SEF and SER primers

1.2.2 DNA提取

在甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系和臨保系與純合兩型系雜交后代中各選取18粒種子進(jìn)行發(fā)芽,從‘核雜17號(hào)’雜交種中選取96粒種子進(jìn)行發(fā)芽,待生長至子葉期提取DNA。將油菜莖葉組織置于提前滅菌、預(yù)冷的2 mL離心管中,采用CTAB法提取植株的基因組DNA。DNA提取完成后,加入一定量TE buffer震蕩混勻,利用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(美國賽默飛世爾科技公司)測(cè)定DNA的濃度與OD260∕280值,對(duì)于DNA質(zhì)量合格的單株樣品,加ddH2O將DNA質(zhì)量濃度稀釋到50 ng∕μL,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR分析

以提取的DNA為模板,采用Bio-Rad PTC200梯度PCR儀(美國伯樂公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,36個(gè)循環(huán);72℃終延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后,取10 uL PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠檢測(cè),凝膠檢測(cè)采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR+(美國伯樂公司)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴(kuò)增結(jié)果

利用設(shè)計(jì)的SNP擴(kuò)增引物,分別對(duì)甘藍(lán)型油菜顯性核不育恢復(fù)系和臨保系材料進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn):以恢復(fù)系DNA為模板擴(kuò)增,出現(xiàn)1 051 bp和924 bp兩條擴(kuò)增帶,以臨保系DNA為模板擴(kuò)增,只有1 051 bp一條擴(kuò)增帶(圖2),表明該標(biāo)記可有效區(qū)分甘藍(lán)型油菜顯性核不育恢復(fù)系和臨保系。

圖2 引物SEF和SER在恢復(fù)系和臨保系材料中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of restorer line and temporary maintainer line by primers SEF and SER

2.2 測(cè)交群體驗(yàn)證

以甘藍(lán)型油菜雙低純合兩型系4078AB內(nèi)可育株為母本,分別與臨保系3008和恢復(fù)系3012配制雜交組合,從每個(gè)雜交F1代中選取18粒種子進(jìn)行發(fā)芽,編號(hào)后每個(gè)單株取幼嫩葉片,提取DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳分離。結(jié)果表明:恢復(fù)系3012雜交F1代比臨保系3008雜交F1代多出一條924 bp的多態(tài)性條帶(圖3)。次年田間育性調(diào)查結(jié)果顯示:臨保系3008雜交F1群體的25個(gè)單株全部為不育株,恢復(fù)系3012雜交F1群體的42個(gè)單株全部為可育株,與利用引物SEF和SER檢測(cè)結(jié)果高度一致。因此,引物SEF和SER可用于鑒定甘藍(lán)型油菜顯性核不育恢復(fù)系和臨保系。

圖3 引物SEF和SER在測(cè)交群體3008和3012中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of testcross populations 3008 and 3012 by primers SEF and SER

2.3 雜交種純度鑒定

以甘藍(lán)型油菜雙低純合兩型系4078AB內(nèi)可育株為母本,‘滬油15’為父本,通過雜交、回交和系譜法選育恢復(fù)系;以‘川油17’為母本,雙低純合兩型系4120AB內(nèi)可育株為父本,通過雜交、回交和系譜法選育臨保系和純合兩型系。在獲得雙低顯性核不育三系后,以純合兩型系內(nèi)的不育株為母本、臨保系為父本,生產(chǎn)全不育系,然后以其為母本,與恢復(fù)系生產(chǎn)’核雜17號(hào)’雜交種。由于雜交種F1基因型中同時(shí)具有臨保系和恢復(fù)系基因,擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)有1 051 bp和924 bp兩條擴(kuò)增帶,若雜交種中混雜恢復(fù)系,擴(kuò)增結(jié)果只有1 051 bp一條擴(kuò)增帶。為檢測(cè)‘核雜17號(hào)’雜交種的純度,從‘核雜17號(hào)’雜交種中選96粒種子發(fā)芽,提取DNA,然后采用引物SEF和SER檢測(cè)。結(jié)果表明:其中90株有1 051 bp和924 bp兩條擴(kuò)增帶,6株僅有1 051 bp一條擴(kuò)增帶(圖4),檢測(cè)純度為93.8%,準(zhǔn)確率為100%?？梢?開發(fā)的分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確、有效地鑒定甘藍(lán)型油菜‘核雜17號(hào)’雜交種的純度。

圖4 引物SEF和SER在‘核雜17號(hào)’雜交種中的驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Test results of‘Heza 17’hybirds by primers SEF and SER

3 結(jié)論與討論

甘藍(lán)型油菜核不育雄性三系法構(gòu)建的授粉控制系統(tǒng),由臨保系與純合型不育系生產(chǎn)全不育系,解決了核雄性不育兩系法應(yīng)用過程中需拔除不育系中一半可育株的問題,提升了制種水平,降低了生產(chǎn)成本[6,9]。目前,作物雜種優(yōu)勢(shì)利用普遍應(yīng)用三系法制種[30-32]。甘藍(lán)型油菜核雄性不育三系雜交系統(tǒng)需要選育純合兩型系、臨保系和恢復(fù)系,不僅育種周期較長,而且臨保系與恢復(fù)系的純度會(huì)直接影響到所生產(chǎn)雜交種的純度。本研究開發(fā)能有效用于區(qū)分恢復(fù)系和臨保系的分子標(biāo)記,旨在利用該分子標(biāo)記鑒定顯性核不育油菜雜交種的純度,給油菜雜交種的純度鑒定提供一條比較簡(jiǎn)捷的途徑。

雜交種子的真?zhèn)魏图兌葯z驗(yàn)是雜種種子質(zhì)量檢驗(yàn)的重要內(nèi)容,形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記均能夠用于雜交種純度的鑒定。形態(tài)學(xué)標(biāo)記鑒定雖然簡(jiǎn)單、快速、易于觀察,但易受環(huán)境條件和人為因素的影響。生化標(biāo)記鑒定容易操作,但是多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目少,標(biāo)記不具有共顯性。分子標(biāo)記種類和數(shù)量較多,遍及整個(gè)基因組,具有共顯性。本研究應(yīng)用SEF和SER分子標(biāo)記對(duì)甘藍(lán)型油菜顯性核不育雜交種‘核雜17號(hào)’進(jìn)行純度鑒定,出現(xiàn)1 051 bp和924 bp兩條擴(kuò)增帶的為‘核雜17號(hào)’雜交種,只有1 051 bp一條擴(kuò)增帶的是混雜的恢復(fù)系,檢測(cè)純度為93.8%,準(zhǔn)確率為100%?？梢?本研究開發(fā)的SNP分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確、有效地鑒定甘藍(lán)型油菜‘核雜17號(hào)’雜交種的純度。

本研究通過對(duì)甘藍(lán)型油菜A8和A5染色體已知序列片段與顯性核不育恢復(fù)基因BnMS5a和臨保基因BnMS5c序列比對(duì),挖掘SNP位點(diǎn),設(shè)計(jì)SNP引物,并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)方法,建立了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)體系,為甘藍(lán)型油菜顯性核不育恢復(fù)系和臨保系的鑒定提供了技術(shù)支撐。