黎硯書 徐麗瑛 肖小華

摘要：綜述了在3R運(yùn)動和體外科學(xué)技術(shù)的推動下，各國替代方法在化學(xué)品及化妝品毒性測試中的驗(yàn)證和法規(guī)認(rèn)可現(xiàn)狀。討論了替代方法在皮膚刺激、眼刺激、皮膚致敏、全身毒性、遺傳/生殖/發(fā)育毒性等毒理學(xué)終點(diǎn)的應(yīng)用。最后提出，生物安全評價作為醫(yī)療器械的重要評價指標(biāo)，醫(yī)療器械的動物替代方法也將成為趨勢，上述替代方法均可嘗試在醫(yī)療器械的生物安全評價中使用。

關(guān)鍵詞：醫(yī)療器械 替代方法

【中圖分類號】R197.39 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）11-01

自1959年Russel和Burch發(fā)表《人道實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理》一書中第一次提3R（reduce、refine、replace）理論以來，尤其從2013年3月11日起，歐盟委員會下令全面禁止用動物對化妝品的安全性測試和銷售，包括化妝品成分。以減少、優(yōu)化和替代為核心的動物試驗(yàn)替代方法已經(jīng)被愈來愈多的的科學(xué)家所接受，在實(shí)際研究工作中得到了廣泛的應(yīng)用。醫(yī)療器械作為人類生活的必需品，保證其臨床使用的安全越來越受到各國政府和學(xué)術(shù)界的重視。因此，在醫(yī)療器械領(lǐng)域減少動物的使用，甚至完全替代動物試驗(yàn)也將是一種趨勢。那么開發(fā)和研究適用于醫(yī)療器械安全性評價的體外替代方法勢在必行。本文就可用于醫(yī)療器械生物學(xué)評價的替代方法做一簡述，為開發(fā)和研究適用于我國醫(yī)療器械安全評價替代方法提供參考。

1 世界各國動物實(shí)驗(yàn)禁令現(xiàn)狀

歐盟于2013年3月全面禁止化妝品動物實(shí)驗(yàn)并禁止銷售經(jīng)過動物測試的化妝品，同時要求成員國禁止進(jìn)口違反上述禁令的化妝品。

除了歐盟以外，挪威在2013年與歐盟同步禁止了化妝品的動物試驗(yàn)。以色列自2007年5月起禁止化妝品、個人護(hù)理用品和洗滌劑進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，2013年1月實(shí)施銷售禁令。2014年5月印度開始禁止使用動物進(jìn)行化妝品測試，自2014年11月起禁止進(jìn)口經(jīng)動物檢測的化妝品。澳大利亞于2014年和2016年先后提出終止殘忍議案，從2017年起禁止實(shí)施化妝品動物試驗(yàn)及銷售經(jīng)過動物試驗(yàn)測試的化妝品。2015年新西蘭開始禁止化妝品及成分在研發(fā)、生產(chǎn)、測試、教學(xué)中使用動物試驗(yàn)。2017年巴西在2014年禁止化妝品動物試驗(yàn)法案基礎(chǔ)上進(jìn)行的修改，禁止成品和原料的動物試驗(yàn)。2018年韓國全面禁止成品和原料的動物試驗(yàn)。自2019年開始中國臺灣省禁止化妝品成品及原料的動物試驗(yàn)。零殘忍化妝品測試法規(guī)已成為全球趨勢。

2 在醫(yī)療器械生物安全評價中的應(yīng)用

在以歐盟為代表的化學(xué)品和化妝品動物實(shí)驗(yàn)禁令的實(shí)施，各國政府及學(xué)術(shù)界均投入大量人力物力開發(fā)替代方法，同時驗(yàn)證機(jī)構(gòu)、標(biāo)準(zhǔn)化組織和監(jiān)管機(jī)構(gòu)也加快了替代方法的認(rèn)可速度，多項替代方法已獲認(rèn)可或已向經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）提交草案的方法，還有很多新的方法正在開發(fā)和驗(yàn)證的程序中[1～2]。

醫(yī)療器械生物安全性評價目前涉及的項目除細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、部分遺傳毒性試驗(yàn)、部分血液相容性試驗(yàn)等項目是體外方法外，其余項目都是在動物體內(nèi)進(jìn)行的，因此，尋求可用的替代方法對于減少和替代動物的使用至關(guān)重要。

2.1 皮膚刺激替代方法

目前，經(jīng)過OECD驗(yàn)證的用于皮膚腐蝕的新的替代方法包括重組人表皮模型（RHE）、體外膜屏障試驗(yàn)方法、大鼠經(jīng)皮膚電阻試驗(yàn)，用于皮膚刺激的替代方法有重組人表皮模型試驗(yàn)。

根據(jù)ECVAM科學(xué)咨詢委員會發(fā)布公告，EpiSkin、EpiDerm和SkinEthic這3種組織工程皮膚模型能夠根據(jù)OECD TG431操作指南來區(qū)分腐蝕性和非腐蝕性化合物，可以將其作為皮膚腐蝕性化合物檢測的動物替代方法[3-4]。在2014年9月歐萊雅在中國獲得人體皮膚重建模型EpiSkin的營業(yè)執(zhí)照，開啟了組織工程在中國的研究與應(yīng)用[5]。

2.2 皮膚致敏替代方法

根據(jù)皮膚致敏的機(jī)制而設(shè)計的離體試驗(yàn)，包括直接多肽反應(yīng)試驗(yàn)（DPRA），基于ARE-Nrf2通路的熒光酶試驗(yàn)，人細(xì)胞系活化試驗(yàn)（h-CLAT）。DPRA試驗(yàn)是利用受試物與合成的兩條7肽寡肽鏈氨基酸（分別為半胱氨酸多肽和賴氨酸多肽）在體外環(huán)境中結(jié)合，然后通過液相色譜發(fā)分析反應(yīng)前后兩種氨基酸曲線下面積來分析受試物與氨基酸的結(jié)合率來預(yù)測受試物的引起過敏的可能性。Masaaki[6]等利用人單核白血病細(xì)胞（THP-1）以CD86和CD54為指標(biāo)建立了皮膚致敏性的體外評價體系，即人細(xì)胞系活化試驗(yàn)。THP-1細(xì)胞與不同濃度2，4-二硝基氯苯（DNCB）共培養(yǎng)24小時后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測共刺激分子CD86與CD54表達(dá)變化，以及細(xì)胞活力與CD86/CD54表達(dá)的關(guān)系[7]。利用已知致敏劑DNCB處理后，共刺激分子CD86與CD54表達(dá)都增加，而非致敏劑DMSO和SLS處理后觀察不到此變化[8]。

2.3 全身毒性替代方法

全身毒性包括急性、亞急性、亞慢性和慢性全身毒性。OECD于 2010 年正式發(fā)布“利用細(xì)胞毒性試驗(yàn)預(yù)測急性毒性經(jīng)口毒性試驗(yàn)初始劑量”的指導(dǎo)原則。ECVAM提出正常人角質(zhì)細(xì)胞或Balb/c 3T3細(xì)胞中性紅攝取試驗(yàn)可以用于確定急性毒性起始劑量。曾麗海[9-10]研究也顯示BALB/c 3T3 細(xì)胞中性紅攝取試驗(yàn)?zāi)軌蜉^好地預(yù)測急性毒性。除此之外，OECD于2001年發(fā)布了3種急性經(jīng)口實(shí)驗(yàn)替代方法的最新修訂版，并于2002年廢除了傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法，我國則于2008年將上述方法接納為化學(xué)品檢驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)。譚劍斌[11]等采用3種替代法（固定劑量法、急性毒性分級法和上下法）與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法的比較，參照OECD TG423進(jìn)行，研究結(jié)果與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法間具有較高一致性和相關(guān)性，且此3種方法所使用的動物比傳統(tǒng)方法明顯減少，因此他認(rèn)為這3種方法具有取代傳統(tǒng)檢測方法的潛力。

其余全身毒性試驗(yàn)尚無驗(yàn)證的替代方法。步犁等[12]認(rèn)為有些化學(xué)物雖然急性毒性作用極低，卻有可能亞慢性或慢性毒性.如某些重金屬、氫醌、苯胺類、肽酸酯類等，因此查明受試物（如化妝品）中可能含有的具有慢性毒性作用的化學(xué)物，評估其反復(fù)接觸后產(chǎn)生的健康風(fēng)險是保障化妝品消費(fèi)安全的關(guān)鍵措施之一。

2.4 遺傳/生殖/發(fā)育毒性替代方法

遺傳毒性試驗(yàn)是采用哺乳動物或非哺乳動物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母菌或真菌測定受試物樣品是否引起基因突變、染色體結(jié)構(gòu)畸變以及其他DNA或基因變化的試驗(yàn)，根據(jù)《GBT 16886.3-2008醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第3部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)》規(guī)定，細(xì)菌基因突變試驗(yàn)、哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)和哺乳動物細(xì)胞誘裂性試驗(yàn)體外試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，為避免動物的過度使用，通常不再論證并不宜再進(jìn)行動物遺傳毒性試驗(yàn);若全部結(jié)果均為陽性，則應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)誘變性試驗(yàn)，否則推定該化合物為誘變物。

根據(jù)《GBT 16886.3-2008醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第3部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗(yàn)》規(guī)定，在確定進(jìn)行生殖和發(fā)育毒性試驗(yàn)之前，應(yīng)在評價醫(yī)療器械使用中引發(fā)生殖和發(fā)育毒性風(fēng)險的基礎(chǔ)上對進(jìn)行試驗(yàn)的決定予以論證;對可吸收醫(yī)療器械或含可溶出物質(zhì)的醫(yī)療器械，如果在吸收、代謝和分布研究方面有充分可靠的數(shù)據(jù)，或材料或醫(yī)療器械浸提液中鑒別出的所有成分均無生殖和發(fā)育毒性時，就無需進(jìn)行生殖毒性試驗(yàn);對醫(yī)療器械進(jìn)行可接受的生物學(xué)風(fēng)險評估后，如生殖和發(fā)育毒性的風(fēng)險已被排除，則無需進(jìn)行動物試驗(yàn)。

3 結(jié)語

醫(yī)療器械作為人類生活的必需品，保證其臨床使用的安全越來越受到各國政府和學(xué)術(shù)界的重視。上述所有的國外化學(xué)品及化妝品領(lǐng)域應(yīng)用的替代方法均可嘗試在醫(yī)療器械的生物安全評價中使用。以上這些替代方法將大大節(jié)省動物資源和安全性評價投入。而我國目前還沒有建立醫(yī)療器械非動物體外毒理學(xué)研究方法，無法實(shí)現(xiàn)與歐盟、美國、OECD等國家和國際組織先進(jìn)方法的接軌。 尋求可用的醫(yī)療器械替代方法可積極響應(yīng)3R的倡導(dǎo)，以及為我國醫(yī)療器械替代方法驗(yàn)證提供參考，盡量排除我國進(jìn)出口貿(mào)易因動物試驗(yàn)而存在的技術(shù)壁壘。

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