陳文靜 翟麗麗 劉惠銘 于兵 崔博舒 曾小軒 郭慧琦 樊偉業(yè)

摘要：目前，甲狀腺癌的治療選擇仍然有限。本研究旨在調(diào)查ZFAS1在癌癥的各種主要特征中的作用以及甲狀腺癌細胞的潛在機制。通過生物信息學預測并通過進行雙熒光素酶測定法研究長鏈非編碼RNA（lncRNA），microRNA（miRs）和靶基因之間的相互作用。通過逆轉錄定量PCR和蛋白質印跡法測定mRNA和蛋白質表達。分別通過Transwell實驗，創(chuàng)傷修復和Cell Counting Kit-8（CCK8）分析評估細胞的侵襲，遷移和增殖活力。結果表明，lncRNA ZFAS1在甲狀腺癌組織，TT和SW579細胞中表達上調(diào)，并且與這兩種細胞系的增殖有關。值得注意的是ZFAS1的下調(diào)降低了細胞的遷移和侵襲能力，并拮抗了miR-302a-3p抑制劑對TT和SW579細胞增殖，遷移和侵襲的促進作用。此外，ZFAS1通過調(diào)控miR - 302a - 3p靶向影響cyclin D1 （CCND1），并且ZFAS1的下調(diào)不僅逆轉了miR-302a-3p抑制劑對CCND1表達以及TT和SW579細胞上皮間質轉化（EMT）的促進作用，而且還靶向并增加了miR-302a- 3p的表達，并進一步降低CCND1的表達，從而抑制甲狀腺癌細胞的增殖，遷移，侵襲和EMT。

【中圖分類號】R736.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）11--04

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一（1），在許多地區(qū)（1，2），例如美國（3）、韓國（4）和南歐國家（5）發(fā)病率最高。根據(jù)美國癌癥協(xié)會的最新數(shù)據(jù)，2019年有甲狀腺癌52，070例新增病例和2170例死亡病例（3）。根據(jù)其病理特征，甲狀腺癌可分為乳頭狀甲狀腺癌，濾泡性甲狀腺癌，甲狀腺髓樣癌和未分化甲狀腺癌（6）。目前，分化型甲狀腺癌的治療方法主要是手術切除，抑制甲狀腺激素，放射性碘治療和分子靶向治療（7）。然而，由于甲狀腺癌的強侵襲性和遷移性及其高度惡性，治療后許多患者經(jīng)常發(fā)生復發(fā)或遠處轉移（8）。因此，研究甲狀腺癌轉移的分子機制及甲狀腺癌分子標記和靶標對于癌癥的治療極其重要。

長鏈非編碼（lnc）RNA是長度> 200個核苷酸且沒有蛋白質編碼功能的RNA。IncRNA可以調(diào)節(jié)許多生物學過程。lncRNA參與人體生長和發(fā)育以及多種疾病的發(fā)生，例如癌癥（10）及腎小球和腎小管間質性腎臟病（11）。先前的研究表明，lncRNA廣泛轉錄和調(diào)控基因組，各種lncRNA在染色質重塑、轉錄、切割和翻譯等多種生物過程中起著重要作用（12）。腫瘤的基因表達譜表明了lncRNA在腫瘤中的異常表達，說明lncRNA參與了腫瘤發(fā)生的一般機制（13，14）。

ZFAS1在動脈粥樣硬化（15）和卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌和肝細胞癌（16-19）等多種癌癥中起作用。 ZFAS1是預測甲狀腺癌預后的可能生物標志物（20）。 Han等人（20）研究表明（hsa）-microRNA（miRNA / miR）-150-5p和hsa-miR-590-3p是甲狀腺癌細胞中與ZFAS負相關的內(nèi)源RNA。ZFAS1通過使miR-590-3p變海綿并增加高遷移率AT-hook 2的表達來促進甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展（21）。 IncRNA使不同的miRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞功能的作用（22）。此外，據(jù)報道m(xù)iR-302a-3p在肝細胞癌（23）和胰腺導管腺癌（24）等多種疾病中起作用。長基因間非蛋白編碼RNA（LINC）01016通過調(diào)節(jié)miR-302a-3p / miR-3130-3p /核轉錄因子Y亞基α/ SATB同源盒1軸來促進子宮內(nèi)膜癌細胞的發(fā)生（25）。另外，miR-302a-3p通過抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲來抑制肝細胞癌的發(fā)展（23）。但是， miR-302a-3p在甲狀腺癌中的作用尚未報道過。

本研究調(diào)查了ZFAS1在甲狀腺癌細胞的增殖，遷移，侵襲和上皮-間質轉化（EMT）中的作用，并探索了下游miRNA和靶基因，通過該基因ZFAS1對甲狀腺癌細胞發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用。

1材料和方法

本研究得到齊齊哈爾市第一醫(yī)院倫理委員會批準（批準號：QR20180503112）。從患者（年齡范圍：28-65歲;男性，11;女性：19）中提取癌及鄰近組織（距癌組織≥5 cm）的樣本（n = 30）。本研究的患者納入標準如下：通過病理檢查確定為甲狀腺癌的患者;以及術前未接受放療或化療的患者。根據(jù)ZFAS1的中位表達值，將患者分為低表達組和高表達組。

1.細胞培養(yǎng)

Nthy-ori3-1（上海亞吉生物科技有限公司）（26），MDA-T68 [American Type Culture Collection（ATCC）]（27），SW579（ATCC）（28），B-CPAP（中國科學院細胞庫）（29）和TPC-1（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏庫）（30）細胞系將其在RPMI 1640（目錄號21875091; Thermo Fisher Scientific，Inc）中培養(yǎng)。 TT細胞（ATCC）（28）在DMEM（目錄號D0819; Sigma-Aldrich; Merck KGaA）中培養(yǎng)。培養(yǎng)基均含有10%FBS（目錄號F8192; Sigma-Aldrich; Merck KGaA），37°C，5%CO2孵箱下孵育。

2.實驗設計

研究使用小干擾（si）RNA下調(diào)ZFAS1表達的效果，將TT和SW579細胞分為以下幾組：1）對照（無轉染）;2）si-Control（用50 nM si-Control轉染）;3）si-ZFAS1（用50 nM si-ZFAS1轉染）。 si-Control（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'）和si-ZFAS1（5'-CUAACUGCCUACCUGCAUATT-3'）購自上?；蛑扑幱邢薰?，并用Lipofectamine?3000（目錄號：No. L3000015; Thermo Fisher Scientific，Inc.）。為了在甲狀腺癌的特征上明確miR-302a-3p和ZFAS1之間的聯(lián)系，將TT和SW579細胞分為以下幾組：1）對照（無轉染）; 2）抑制劑陰性對照（NC;轉染50 nM miR-302a-3p抑制劑-NC; 3）抑制劑（轉染50 nM miR-302a-3p抑制劑）;4）抑制劑+ si-ZFAS1（用50 nM miR-302a-3p抑制劑和50 nM si-ZFAS1轉染）; 5）si-ZFAS1（用50 nM si-ZFAS1轉染）。 miR-302a-3p抑制劑-NC（5'- CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'）和miR-302a-3p抑制劑（5'- UCACCAAAACAUGGAAGCACUUA-3'）購自上?；蛑扑幱邢薰?，細胞（2x104個細胞）使用Lipofectamine?3000（目錄號L3000015; Thermo Fisher Scientific，Inc.）轉染/孔; 96孔板）。細胞培養(yǎng)24小時。

3.逆轉錄定量（RT-q）PCR

使用試劑（目錄號15596018;賽默飛世爾科技公司）從組織樣品和細胞（1x106個細胞）中提取總RNA。對于miRNA分析，使用TaqMan?MicroRNA逆轉錄試劑盒（目錄號4366597; Thermo Fisher Scientific，Inc.）根據(jù)制造商的規(guī)程，對200 ng總RNA進行cDNA合成。逆轉錄條件包括：42℃30分鐘和85℃5分鐘。使用2μlcDNA溶液，5μlTaqMan 2X Perfect Master Mix（Takara Biotechnology Co.，Ltd。），0.25μl基因特異性引物和2.75μl無核酸酶的水進行定量PCR反應，最終體積為10μl。一個Bio-Rad IQ5熱循環(huán)儀（Bio-Rad Laboratories，Inc.）在以下條件下：在95°C下初始變性3分鐘，然后在95°C下進行40循環(huán)30秒，在62°C下進行30秒和72次?C25秒。 U6基因用作內(nèi)部對照。為了進行mRNA分析，使用PrimeScript RT試劑盒（Takara Biotechnology Co.，Ltd。）將mRNA模板逆轉錄成cDNA。逆轉錄條件：37°C 30分鐘和85°C 5分鐘。根據(jù)FastStart?Universal SYBR Green Master的協(xié)議（Rox;目錄號4913850001; Roche Diagnostics），14μl2X SYBR Green主混合物，1μl正向引物（10μM），1μl反向引物（10μM），將3μlcDNA模板和6μl雙重蒸餾的H2O混合并在Bio-Rad IQ5熱循環(huán)儀（Bio-Rad Laboratories，Inc.）中在以下條件下反應：95°C持續(xù)90秒，95°C持續(xù)25秒，65 ?C持續(xù)20秒，72 30C持續(xù)30秒，持續(xù)40個循環(huán)。 GAPDH用作內(nèi)部對照。 mRNA表達水平通過2-ΔΔCq法計算（31）。

4.Transwell分析

收集對數(shù)生長期TT和SW579細胞（1x106），并吸移到預先涂有Matrigel（BD Bioscience; 37°C）的Transwell插入物（8-μm）的上腔室（含無血清培養(yǎng)基）中。（持續(xù)4小時）。在下腔室中添加了在400μl培養(yǎng)基中混合的10%FBS。 Transwell在37°C和5%CO2中孵育24小時。接下來，用棉簽除去保留在上腔室表面上的細胞，將侵襲的細胞在室溫下用4%多聚甲醛固定15分鐘，然后在室溫下用0.2%結晶紫染色10分鐘。在光學顯微鏡下（放大倍數(shù)，×200）觀察下腔室中的細胞，并使用Image J軟件（1.8.0版;美國國立衛(wèi)生研究院）對細胞進行計數(shù)。

5. 生物信息學和雙熒光素酶報告基因分析

ZFAS1和miR - 302a - 3p以及cyclin D1 （CCND1）和miR - 302a - 3p之間的相互作用是由Starbase（版本2.0;http：//starbase.sysu.edu.cn）預估。ZFAS1和CCND1的突變體是使用快速改變位點定向突變試劑盒（安捷倫技術公司）構建的。編碼熒光素酶報告基因的質粒pGL3購自Promega公司。構建了含有野生型（WT） ZFAS13，未翻譯區(qū)（UTR）、野生型CCND13，UTR或相應突變序列的重組質粒。TT和SW579細胞（1 × 105細胞/孔）接種在24孔板中，并用miR - 302a - 3p mimic （40 nM;5' uaa gug cuu cca ugu uuu ggu ga ';上?；蛑扑幱邢薰荆┗騧iRNA對照（40 nM;5' uuc ucc gaa cgu guc acg utt 3';重組質粒（20 ng）或相應的突變體（20 ng）使用Lipofectamine 3000。質粒pRL胸腺嘧啶激酶;作為熒光素酶的內(nèi)參。在使用Dual - Glo熒光素酶檢測試劑盒（Promega Corporation）檢測熒光素酶活性之前，細胞培養(yǎng)48小時。熒光素酶活性歸一化為Renilla熒光素酶活性。

6.傷口愈合試驗

在對數(shù)生長期收集TT和SW579細胞（1 × 106）。用無菌的200?l移液管尖端在單層細胞上劃痕，在細胞層中間形成一個間隙。洗滌后，用無血清培養(yǎng)基處理細胞48小時，并在37?C的5% CO2中孵育。使用光學顯微鏡（放大率，x100）捕捉圖像，并通過ImageJ軟件1.8.0（美國國立細胞計數(shù)試劑盒- 8 （CCK - 8）檢測。si - ZFAS1或miR - 302a - 3p抑制劑轉染TT和SW579細胞（1 × 106），分成組（對照、si -對照、si - ZFAS1、抑制劑- NC、抑制劑、抑制劑+ si - ZFAS1）培養(yǎng)24、48和72小時。通過CCK - 8檢測細胞活力Cat.no.96992 - 100測試- F;σ-奧爾德里奇;默克公司（Merck KGaA）。采用Multiskan酶標儀（Thermo Fisher Scientific， Inc.）在450 nm處測定吸光度。

7.Western-blotting

細胞轉染24小時后，獲得1 × 106個細胞，并用RIPA裂解液裂解與蛋白酶抑制劑測定總蛋白濃度。用12% SDS - PAGE將蛋白（25?g/lane）分離，然后轉移到PVDF膜上。室溫下用5%脫脂乳封閉膜1小時，并與抗周期蛋白D1 （1：10000）; MMP2 （1：1000）;E - cadherin （1：10000;N -鈣粘蛋白（1?g/ml）;和GAPDH （1：10，000）（全部購自Abcam）一抗，在4?C過夜。然后用TBS - Tween 20 （0.1% Tween - 20）洗滌膜，并與山葵過氧化物標記的山羊抗兔二抗（1：2000）在室溫下保存1小時。蛋白印跡是使用SignalFire?ECL試劑（cat.no.6883;Cell Signaling Technology， Inc.），并使用ImageJ軟件（version 1.46）進行分析。

8.統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)表示為三個獨立實驗的平均值±SD。配對和未配對的兩組之間的統(tǒng)計學差異通過t檢驗分析，多組之間的差異則是通過單向或雙向方差分析（針對CCK-8數(shù)據(jù)）進行分析，然后進行Tukey事后檢驗。Pearson相關系數(shù)檢驗用于相關性分析，F(xiàn)isher精確檢驗和X2檢驗用于分析不同變量之間的關聯(lián)。 使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software，Inc.）分析所有結果。 P <0.05認為統(tǒng)計學上顯著差異。

2結果

甲狀腺癌組織和細胞系中ZFAS1表達水平上調(diào)，并與甲狀腺癌細胞的增殖呈正相關。為了研究ZFAS1在甲狀腺癌中的表達和作用，檢測了ZFAS1在腫瘤組織和細胞系中的表達水平。此外，測定了沉默表達ZFAS1的TT和SW579細胞的細胞活力。結果表明，與鄰近組織相比，甲狀腺癌組織中ZFAS1表達水平上調(diào)，與Nthy-ori3-1細胞相比，MDA-T68，TT，SW579，B-CPAP和TPC-1細胞中ZFAS1表達水平上調(diào)（P <0.01;圖1A和B）。此外，分析了ZFAS1表達與臨床特征之間的關聯(lián)，結果表明ZFAS1表達水平與腫瘤大小，淋巴結狀態(tài)和腫瘤分期顯著相關（表I）。

在si-ZFAS1組中，相比于si-對照組，在TT和SW579細胞中ZFAS1表達水平顯著降低（P <0.01;圖1C和D）。值得注意的是，在24、48和72小時后，si-ZFAS1組的TT和SW579細胞的細胞活力明顯低于si-對照組（P <0.05或P <0.01;圖1E和F）。這些結果表明ZFAS1的表達水平在甲狀腺癌中升高并且與甲狀腺癌的增殖有關。

ZFAS1表達水平的降低會降低甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲能力。 si-ZFAS1轉染了TT和SW579細胞，與si-對照組相比，si-ZFAS1組在24 h后TT和SW579細胞的遷移和侵襲率顯著降低（P <0.01;圖2），表明ZFAS1表達與甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲能力正相關。

生物信息學預測，miR-302a-3p是ZFAS1的靶基因（圖3A）。與ZFAS1-WT +空白組相比，TT和SW579細胞中ZFAS1-WT +模擬組的相對熒光素酶活性顯著降低（P <0.01;圖3B和C）。 miR-302a-3p是ZFAS1的靶標。此外，結果表明與鄰近組織相比，甲狀腺癌組織中的miR-302a-3p表達水平顯著降低（P <0.01;圖3D），并且ZFAS1與miR-302a-3p的表達水平之間存在負相關關系（圖3E）。另外，抑制劑組中miR-302a-3p的表達水平與抑制劑-NC組相比明顯降低，但在抑制劑+ si-ZFAS1組中，與TT中的抑制劑組相比，其表達水平顯著更高，SW579細胞（P <0.01;圖3F和3G）。另外，與抑制劑+ si-ZFAS1組相比，si-ZFAS1組中的miR-302a-3p表達水平顯著增加（P <0.01;圖3F和3G）。這些結果表明ZFAS1可能靶向miR-302a-3p來調(diào)節(jié)甲狀腺癌細胞的活性。

ZFAS1表達下調(diào)消除了miR-302a-3p抑制對甲狀腺癌細胞的增殖，遷移和侵襲的積極作用。為了研究ZFAS1和miR-302a-3p在甲狀腺癌進展中的作用，研究了使用或不使用si-ZFAS1和miR-302a-3p抑制劑處理的甲狀腺癌細胞的細胞活力，遷移和侵襲的變化。結果表明，與抑制劑-NC組相比，TT和SW579細胞抑制劑組的細胞活力以及遷移和侵襲率顯著提高，而與+ Zi-ZFAS1組相比，它們顯著降低。抑制劑組的那些（P <0.01;圖4）。此外，與抑制劑+ si-ZFAS1組相比，si-ZFAS1組的細胞活力以及遷移和侵襲率顯著降低（P <0.01;圖4）。這些結果表明ZFAS1的下調(diào)可能會減弱miR-302a-3p在甲狀腺癌中表達的降低。

miR-302a-3p靶向CCND1。通過生物信息學分析確定了ZFAS1和miR-302a-3p在甲狀腺癌中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的基因。生物信息學分析預測，miR-302a-3p將CCND1靶向甲狀腺癌的發(fā)生（圖5A）。此外，雙熒光素酶報告基因檢測結果表明，與CCND1-WT +空白組相比，CCND1-WT +模擬組中TT和SW579細胞系的相對熒光素酶活性明顯較低（P <0.01;圖5B和C）。

ZFAS1表達水平的下調(diào)逆轉了miR-302a-3p抑制劑對甲狀腺癌細胞CCND1表達的促進作用。探討了CCND1表達是否受ZFAS1和miR-302a-3p在TT和SW579細胞中的調(diào)控。結果表明，與抑制劑-NC組相比，抑制劑組的TT和SW579細胞中CCND1表達水平顯著增加（P <0.01;圖6）。另外，抑制劑+ si-ZFAS1組的CCND1表達水平與抑制劑組相比顯著降低，但與si-ZFAS1組的CCND1表達水平顯著升高（P <0.01;圖6）。這些結果表明miR-302a-3p和CCND1的表達水平呈負相關，而ZFAS1和CCND1的表達水平呈正相關。

3討論

本研究表明，在甲狀腺癌組織和細胞系中ZFAS1表達增加，而ZFAS1表達的下調(diào)（可能通過影響CCND1的表達）通過抑制miR-302a-3p的表達降低了腫瘤細胞的增殖，遷移，侵襲和EMT。這些關于調(diào)節(jié)途徑的新發(fā)現(xiàn)可能有助于甲狀腺癌的干預措施。

參考文獻：

[1]彭書旺， 陳露陽. lncRNA MIR31HG對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖，遷移，侵襲的影響及作用機制研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志， 2020， v.30（12）：19-27.

[2]許玲玉， 張豐姣， 毛雨，等. 長鏈非編碼RNA RP11-385J1.2通過靶向微小RNA-370-3p調(diào)控甲狀腺癌細胞增殖，侵襲及凋亡的作用機制[J]. 癌癥進展， 2020， 018（007）：672-676.

[3]鐘麗穎， 李順東， 孫葉海. 長鏈非編碼RNA PTV1通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲及誘導凋亡[J]. 成都醫(yī)學院學報， 2019， 014（004）：426-430.

項目：齊齊哈爾市科技計劃創(chuàng)新激勵項目 項目編號 CSFGG-2021016