樊 俊，譚 軍，王 瑞*，施河麗，夏鵬亮，趙秀云

1.湖北省煙草公司恩施州公司技術(shù)中心，湖北省恩施市市府路65號 445000 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢市洪山區(qū)獅子街1號 430070

煙草青枯病是由勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種易感染、傳播快、危害大的土傳細(xì)菌性病害，是煙葉生產(chǎn)中的常見病害之一［1］。青枯病侵染煙株會造成植物快速枯死，給煙葉生產(chǎn)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為限制煙草產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸之一［2］。

良好的土壤生態(tài)環(huán)境是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要基礎(chǔ)［3］。土壤的養(yǎng)分平衡是促進(jìn)煙株生長發(fā)育、增強(qiáng)植株抗病能力的關(guān)鍵措施之一［4-5］。李集勤等［6］通過相關(guān)性分析表明，土壤pH與青枯病發(fā)病率、病情指數(shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)。有研究認(rèn)為，土壤板結(jié)、酸堿度不平衡、理化性狀惡化、礦質(zhì)營養(yǎng)不足等可能是煙草青枯病發(fā)生的重要原因［7-8］。另外，土傳病害的發(fā)生與土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和特異性微生物的數(shù)量關(guān)系密切［9-10］。李小龍等［11］試驗(yàn)表明，勞爾氏菌在侵染植物過程中，能夠引起植株感病部位微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化。煙株土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富，多樣性越高，抵抗病原菌的綜合能力越強(qiáng)［12-13］。煙草青枯病的發(fā)生與土壤性狀［14］、微生物結(jié)構(gòu)［15］等有密切關(guān)系，通過調(diào)節(jié)植煙土壤微生態(tài)環(huán)境來抑制青枯病的發(fā)生已成為研究的熱點(diǎn)之一［16-17］。然而，土壤是一個(gè)整體生態(tài)系統(tǒng)，目前不同青枯病發(fā)病程度的土壤理化性狀、微生物群落差異的綜合研究卻鮮見報(bào)道。為此，采用分組分析、典范對應(yīng)分析、相關(guān)性分析、主成分分析和最小數(shù)據(jù)集的方法，研究不同青枯病發(fā)病程度的土壤因子，旨在明確影響青枯病發(fā)病的關(guān)鍵因素，為煙草青枯病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

土壤取樣區(qū)位于湖北省恩施州宣恩縣椒園鎮(zhèn)和曉關(guān)鄉(xiāng)，兩個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)均是湖北省恩施州烤煙主產(chǎn)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)），煙葉種植集中度較高，連作時(shí)間長。為減少其他生態(tài)因素引起的土壤性狀差異，本試驗(yàn)中的取樣點(diǎn)均分布在同一山系，方圓5 km范圍內(nèi)，海拔在900～1 100 m。選樣區(qū)域內(nèi)土壤類型為大泥土，煙草品種為云煙87，在煙苗移栽50 d左右開始發(fā)病；在移栽80 d后，調(diào)查青枯病病情指數(shù)，并選擇不同青枯病病情指數(shù)的煙田進(jìn)行土樣采集。

1.2 病情調(diào)查

按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 39—1996［18］的方法，以株為單位詳細(xì)調(diào)查煙株發(fā)病情況，并計(jì)算病情指數(shù)。

1.3 樣品采集與制備

每塊煙田先確定青枯病病情指數(shù)，再按照“之”形選取10～15株發(fā)病程度相同的煙株，拔出煙株根系，采用抖動法進(jìn)行根際土壤樣品采集，去除雜物并充分混勻后，分為兩份分別裝入保鮮袋和透氣棉質(zhì)袋。保鮮袋中的土樣放入低溫冷藏箱（-20℃）中保存，以提取土壤微生物DNA，進(jìn)行16 S rRNA測序。棉質(zhì)袋中的土樣在室溫下保存，自然風(fēng)干后用于測定土壤化學(xué)指標(biāo)。同時(shí)選擇煙株周圍10～15 cm壟體較完整的區(qū)域采集環(huán)刀樣，將其包好后放入環(huán)刀盒，進(jìn)行土壤物理指標(biāo)的測定。

1.4 土壤理化指標(biāo)測定

用pH計(jì)（PB-10，德國賽多利斯公司）［m（土）∶m（水）=1.0∶2.5］測定土壤pH［19］；重鉻酸鉀容量法測定有機(jī)質(zhì)［19］；擴(kuò)散法測定堿解氮［19］；硫酸-鉬銻抗比色法測定速效磷［19］；火焰光度法測定速效鉀［19］；乙酸銨浸提-原子吸收分光光度法測定交換性鈣、鈉、鎂和陽離子交換量［19］；原子吸收法測定有效鐵、錳、銅和鋅［20］；沸水浸提-姜黃素比色法測定有效硼［20］。采用環(huán)刀烘干法測定土壤容重、含水率、總孔隙度、毛管持水量和通氣孔隙度［21］。

1.5 土壤細(xì)菌群落高通量測序

利用Fast DNA?Spin Kit（美國麥普生物醫(yī)藥公司）試劑盒提取土壤微生物總DNA，采用正向引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'），反向引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對細(xì)菌16S rRNA的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增體系總體積為25μL，包括土壤微生物DNA模板（10 ng/μL）2.5μL、Forward引物（1μmol/L）和Reverse引物（1μmol/L）各5μL、KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。擴(kuò)增后用2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物品質(zhì)，再經(jīng)純化、質(zhì)檢后建立測序文庫，采用Illumina Miseq PE250平臺由北京諾禾致源科技股份有限公司測序［15］。使用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP Classifier對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，選用Silva數(shù)據(jù)庫，得到OTU的分類學(xué)信息［22］。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖，采用LSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，顯著性為P＜0.05。最小數(shù)據(jù)集確定方法：選取不同青枯病發(fā)病程度有顯著（P＜0.05）差異的土壤指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。選擇特征值大于1.0的主成分為研究對象［23］。對每一個(gè)主成分而言，變量載荷因子越大對該主成分貢獻(xiàn)越大，定義因子載荷絕對值在最大因子載荷10%范圍內(nèi)的變量為高權(quán)重變量。高權(quán)重變量間進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r＜0.7時(shí)，各高權(quán)重變量都很重要均被選入最小數(shù)據(jù)集；r＞0.7時(shí)，選擇相關(guān)系數(shù)和最大的高權(quán)重變量為最小數(shù)據(jù)集指標(biāo)［24］。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙田青枯病發(fā)病程度分析

對不同編號的煙田進(jìn)行青枯病發(fā)病程度調(diào)查（圖1），病情指數(shù)為0到1的有8塊，為不發(fā)病土壤（編號為1～8）；病情指數(shù)在1到15之間的有6塊，平均病情指數(shù)為4.39，為中等發(fā)病土壤（編號為9～14）；病情指數(shù)在15以上的有10塊，平均病情指數(shù)為83.09，為高發(fā)病土壤（編號為15～24）。

圖1 煙田青枯病病情指數(shù)分布Fig.1 Disease index of bacterial wilt in tobacco fields

2.2 土壤理化性狀分析

由表1可以看出，土壤pH、交換性鈣（ECa）、有效錳（AMn）、有效鋅（AZn）、有效硼（AB）、堿解氮（AN）、速效磷（AP）在不發(fā)病與高發(fā)病土壤間存在顯著差異。土壤速效鉀（AK）、交換性鎂（EMg）、交換性鈉（ENa）、有效銅（ACu）、有效鐵（AFe）、有機(jī)質(zhì)（SOM）、陽離子交換量（CEC）在不發(fā)病與高發(fā)病土壤間差異不顯著。青枯病病情指數(shù) 與 土 壤pH、ECa、AMn、AZn和 通 氣 孔 隙 度（SAP）呈顯著負(fù)相關(guān)（表2），相關(guān)系數(shù)（r）分別為-0.555、-0.499、-0.463、-0.447、-0.443，與土壤含水率（SWC）和土壤毛管持水量（SCC）呈顯著正相關(guān)，r為0.427和0.495，表明土壤pH、ECa、AMn、AZn和SAP的增加與SWC和SCC的降低可能會抑制煙草青枯病的發(fā)生。

表1 青枯病不同發(fā)病程度的土壤基本理化性狀分析①②Tab.1 Physicochemical properties of soils with different disease severities of bacterial wilt

表2 病情指數(shù)與土壤基本理化性狀相關(guān)性分析①Tab.2 Correlation analysis between disease index of bacterial wilt and soil physicochemical properties

2.3 土壤細(xì)菌門水平分析

從圖2可以看出，不同青枯病發(fā)病程度的土壤細(xì)菌中所占比例較高的門有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）等。比較不同發(fā)病程度細(xì)菌門類的差異，變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、Candidatus_Saccharibacteria、Cyanobacteria、Armatimonadetes在發(fā)病土壤中的相對豐度高于不發(fā)病土壤；酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）等在不發(fā)病土壤中的相對豐度高于高發(fā)病土壤。隨著青枯病病情指數(shù)的增加，變形菌門、綠彎菌門、Candidatus_Saccharibacteria的相對豐度分別從24.40%、9.60%、0.54%增加到27.00%、12.50%、0.63%，而厚壁菌門和Latescibacteria的相對豐度從5.00%和0.75%降低到3.30%和0.62%。說明青枯病的發(fā)生對土壤細(xì)菌的主要門類影響較小，對部分細(xì)菌門類如變形菌門、綠彎菌門和厚壁菌門有較大的影響。

圖2 不同青枯病發(fā)病程度土壤細(xì)菌群落在門水平上的組成Fig.2 Compositions of bacterial communities at phylum level in soils with different disease severities of bacterial wilt

2.4 土壤細(xì)菌屬水平分析

不同青枯病發(fā)病程度的植煙土壤中OTUs數(shù)量在前100的細(xì)菌屬超過了全部數(shù)量的90%，多數(shù)細(xì)菌種類數(shù)量并不占優(yōu)勢。不發(fā)病、中等發(fā)病與高發(fā)病土壤細(xì)菌屬中存在顯著性差異，且對煙田青枯病有影響的共10個(gè)屬，其中在不發(fā)病土壤中占優(yōu)勢的有8個(gè)，包括鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、土壤紅桿菌屬（Solirubrobacter）、氣微菌屬（Aeromicrobium）、土微菌屬（Pedomicrobium）、根瘤菌屬（Rhizobium）、貪噬菌屬（Variovorax）、諾卡氏菌屬（Nocardia），另外的沙單胞菌屬（Arenimonas）、勞爾氏菌屬（Ralstonia）在高發(fā)病土壤中占據(jù)優(yōu)勢（表3）。與青枯病病情指數(shù)的相關(guān)性分析表明，鞘氨醇單胞菌屬、土壤紅桿菌屬、根瘤菌屬的OTUs數(shù)量與病情指數(shù)存在顯著負(fù)相關(guān)（-0.565、-0533和-0.443），推測土壤中這3個(gè)屬細(xì)菌數(shù)量的增加有利于抑制煙草青枯病的發(fā)生（表4）。

表3 不同青枯病發(fā)病程度土壤中顯著性差異的細(xì)菌屬OTUs數(shù)量Tab.3 Amount of OTUs of significantly different bacterial genera in soils with different disease severities of bacterial wilt

表4 病情指數(shù)與差異性細(xì)菌屬OTUs數(shù)量的相關(guān)性Tab.4 Correlation analysis between disease index and amount of OTUs of bacterial genera with significantly different OTU amounts

2.5 典型對應(yīng)分析（CCA）

選取在不同發(fā)病程度土壤中存在顯著差異的SWC、SCC、SAP、pH、ECa、AMn、AZn、AB、AN和AP共10個(gè)指標(biāo)作為環(huán)境因子，與細(xì)菌屬水平OTUs數(shù)量進(jìn)行CCA分析。結(jié)果（圖3）表明，CCA1和CCA2可以解釋變量的63.2%的信息。不發(fā)病土壤主要分布在縱坐標(biāo)軸的右側(cè)，高發(fā)病土壤主要分布在縱坐標(biāo)軸的左側(cè)，而中等發(fā)病土壤則在兩側(cè)均有分布。由圖中箭頭分布可以看出，SWC和SCC分布在縱坐標(biāo)軸左側(cè)，與高發(fā)病土壤細(xì)菌存在正相關(guān)；土壤pH、AMn、SAP、ECa、AZn、AN、AB、AP分布在縱坐標(biāo)軸右側(cè)，與不發(fā)病土壤細(xì)菌存在正相關(guān)。AMn對不發(fā)病土壤細(xì)菌影響明顯，而SCC和SWC對發(fā)病土壤細(xì)菌影響顯著。上述分析表明土壤pH、AMn、SAP、ECa、AZn、AN、AB、AP等的增加，可能有利于有益微生物群落的構(gòu)建，進(jìn)而抑制青枯病的發(fā)生，而SCC和SWC則有相反的作用。

圖3 微生物與環(huán)境因子之間的典型對應(yīng)分析（CCA）Fig.3 Canonical correspondence analysis（CCA）between microorganisms and environmental factors

2.6 主成分分析（PCA）

對青枯病病情指數(shù)有顯著差異的10項(xiàng)土壤理化指標(biāo)和青枯勞爾氏菌（Ralstonia）OTUs數(shù)量共11項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行偏相關(guān)度KMO檢驗(yàn)，其KMO值為0.490（P＜0.001），說明指標(biāo)之間存在相關(guān)性，適合進(jìn)行主成分分析。

主成分分析結(jié)果見表5和表6，特征值大于1的主成分（PC）有4個(gè)，方差累積貢獻(xiàn)率占原變量總方差的76.891%，基本保留了原11個(gè)變量的特征、差異和相互關(guān)系，說明這4個(gè)主成分基本反映了青枯病發(fā)病程度的主要影響因素。第1主成分貢獻(xiàn)率為30.629%，其中SCC和SWC主成分載荷相對較高，分別為-0.948和-0.908，說明第1主成分是上述2個(gè)指標(biāo)的綜合反映；第2主成分貢獻(xiàn)率為19.916%，其中pH、ECa和勞爾氏菌屬OTUs數(shù)量主成分載荷相對較高，分別為0.718、0.624和0.638。第3主成分貢獻(xiàn)率為13.630%，其中鞘氨醇單胞菌屬OTUs數(shù)量主成分載荷相對較高，為0.673。第4主成分貢獻(xiàn)率為12.716%，其中根瘤菌屬OTUs數(shù)量和AMn主成分載荷相對較高，分別為0.587和0.558。由此，可將影響青枯病病情指數(shù)的變量分為{SCC、SWC}、{pH、ECa、勞爾氏菌屬OTUs數(shù)量}、{鞘氨醇單胞菌屬OTUs數(shù)量}、{根瘤菌屬OTUs數(shù)量、AMn}共4大類。

表5 主成分分析Tab.5 Principal component analysis

表6 主成分因子載荷分析Tab.6 Factor loading analysis of principal components

2.7 最小數(shù)據(jù)集建立

由表6可知，在PC1中，高因子載荷有SCC和SWC，由于SCC因子載荷最大，且SCC與SWC的相關(guān)系數(shù)為0.952，達(dá)到極顯著水平，因此PC1中SCC選入最小數(shù)據(jù)集。在PC2中，高因子載荷為pH，而ECa和勞爾氏菌屬OTUs數(shù)量的因子載荷未能達(dá)到pH因子載荷的90%，因此PC2中僅pH入選最小數(shù)據(jù)集。在PC3中，高因子載荷有鞘氨醇單胞菌屬OTUs數(shù)量1個(gè)指標(biāo)，因此鞘氨醇單胞菌屬OTUs數(shù)量入選最小數(shù)據(jù)集。在PC4中高因子載荷有根瘤菌屬OTUs數(shù)量和AMn，因?yàn)閮烧呦嚓P(guān)性較?。╮=0.140），均入選最小數(shù)據(jù)集。因此，影響煙草青枯病病情指數(shù)的最小數(shù)據(jù)集包括SCC、pH、鞘氨醇單胞菌屬OTUs數(shù)量、根瘤菌屬OTUs數(shù)量和AMn共5個(gè)指標(biāo)，與青枯病病情指數(shù)相 關(guān) 系 數(shù) 分 別 為0.495、-0.555、-0.565、-0.443和-0.463，表明SCC、pH、鞘氨醇單胞菌屬OTUs數(shù)量、根瘤菌屬OTUs數(shù)量、AMn是煙草青枯病發(fā)生的關(guān)鍵土壤因子。

3 討論

青枯病的發(fā)生不僅受到煙草品種抗性、氣候條件等因素的影響，還與土壤理化性質(zhì)和生物學(xué)特性等有重要關(guān)系［25］。土壤物理結(jié)構(gòu)、養(yǎng)分供應(yīng)水平和酸堿狀況直接或間接影響植物的抗性和土壤病原物的侵染［26］。有學(xué)者認(rèn)為土壤pH、質(zhì)地、通氣狀況、溫度和濕度等對植煙土壤青枯菌菌量和病害發(fā)生有很大影響［27-28］。本研究中發(fā)現(xiàn)，SCC與青枯病發(fā)病程度呈顯著正相關(guān)，可能取樣區(qū)域?yàn)槎跷髂蠠焻^(qū)，在煙葉生長季節(jié)雨水豐富，土壤含水量高，造成壟體通氣不良，影響了根系生長發(fā)育［29］，降低了煙株對根莖部病害的抵抗能力；同時(shí)，土壤濕度大也易于青枯病的發(fā)生［30］。本研究中不發(fā)病土壤pH明顯高于發(fā)病土壤，說明提高土壤pH有利于對煙草青枯病的控制，與譚軍等［27］、鄭世燕等［31］、黎妍妍等［32］的研究結(jié)果一致，其原因可能是酸化會加速土壤中含鋁的原生礦物和次生礦物的風(fēng)化而釋放大量鋁離子［33］，煙株長期和過量吸收鋁的過程中，會導(dǎo)致根系遭到破壞、病菌易于入侵；同時(shí)，pH降低可促進(jìn)土壤青枯勞爾氏菌豐度的增加［34］，致使煙田青枯病發(fā)病程度加重。煙草青枯病的發(fā)生與土壤礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量間存在密切聯(lián)系，如錳、鈣、鉬等［11，35］。有研究表明，土壤中錳是煙草生長發(fā)育必需的微量元素，對維持葉綠體結(jié)構(gòu)有重要作用，能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，增強(qiáng)植物的呼吸強(qiáng)度［35］。本試驗(yàn)中，土壤有效錳與煙草青枯病病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，說明錳素營養(yǎng)可通過增強(qiáng)煙株對青枯病的抵抗能力，降低煙草青枯病的發(fā)生，與前人的研究結(jié)論相似［36］。因此，在大田煙葉生產(chǎn)中，需要注意改善土壤通透性，提高根系發(fā)育水平，調(diào)控土壤酸堿平衡，補(bǔ)充中微量營養(yǎng)元素（尤其是錳、鈣和鋅等），才能有效防控?zé)煵萸嗫莶〉陌l(fā)生。

根據(jù)植煙土壤細(xì)菌16S rRNA測序結(jié)果可以看出，不同青枯病發(fā)病程度土壤之間的細(xì)菌門類組成基本相似，變形菌門、放線菌門和酸桿菌門等是植煙土壤中的優(yōu)勢菌門，這與前人的研究結(jié)果一致［12，37］。同時(shí)，青枯病發(fā)病土壤有增加變形菌門、綠彎菌門和降低厚壁菌門細(xì)菌相對豐度的趨勢，可能煙株青枯病的發(fā)生與土壤中具有生物防治功能的芽胞桿菌類（屬厚壁菌門，如枯草芽胞桿菌等）細(xì)菌相對豐度降低、病原菌類（屬變形菌門，如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等）細(xì)菌相對豐度增加有關(guān)。

土壤中勞爾氏菌屬OTUs數(shù)量是煙草青枯病發(fā)病的重要因子，本研究結(jié)果表明，其與病情指數(shù)的相關(guān)系數(shù)僅為0.158，沒有達(dá)到顯著水平，說明煙草青枯病的發(fā)生除了受到土壤中勞爾氏菌屬OTUs數(shù)量的影響外，可能還與煙株自身的抗性、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)以及土壤水分狀況、養(yǎng)分供應(yīng)水平等因素有關(guān)［12，27，38］。通過主成分分析表明，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和根瘤菌屬（Rhizobium）OTUs數(shù)量對煙草青枯病病情指數(shù)有重要影響。鞘氨醇單胞菌屬在土壤中分布廣泛，相對豐度較高［39］，具有高代謝能力與多功能的生理特性，可用于芳香化合物（如苯基脲類除草劑、六氯化苯等）的生物降解，對維護(hù)土壤生態(tài)平衡具有重要作用［40］。根瘤菌屬為固氮微生物，在氮素缺乏的土壤中具有較強(qiáng)的競爭優(yōu)勢，土壤氮素含量的變化會影響固氮微生物與其他微生物的競爭關(guān)系，從而影響其群落組成［41］。說明土壤中鞘氨醇單胞菌屬和根瘤菌屬等不直接影響青枯病菌的中性微生物數(shù)量增加，但可能改善了土壤生態(tài)環(huán)境和養(yǎng)分供應(yīng)狀況，促進(jìn)煙株的生長發(fā)育，增強(qiáng)了煙株對土傳病害的抗性，進(jìn)而抑制了煙田青枯病的發(fā)生。具體與青枯病的關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

煙草青枯病病情指數(shù)與土壤pH、ECa、AMn、AZn、SAP和鞘氨醇單胞菌屬、土壤紅桿菌屬、根瘤菌屬等菌屬微生物OTUs數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)，與SWC、SCC呈顯著正相關(guān)。主成分和最小數(shù)據(jù)集分析表明，SCC、pH、AMn和鞘氨醇單胞菌屬、根瘤菌屬等的OTUs數(shù)量是影響煙草青枯病發(fā)生的關(guān)鍵土壤因子。