葉長(zhǎng)文，羅凱玉，陳 宸，賈 楠，李 棟，李青常，范 黎，賀 琛*

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào)450001 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市金水區(qū)農(nóng)業(yè)路63號(hào) 450002

芽胞桿菌屬細(xì)菌因其具有抗性強(qiáng)、耐高溫、生長(zhǎng)快以及對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高等特點(diǎn)，在煙葉發(fā)酵和醇化過(guò)程中一直以優(yōu)勢(shì)菌群存在［1-2］。張鴿等［3-4］、杜佳等［5］采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒別法，分別對(duì)雪茄煙葉葉面、茄衣發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌多樣性及演替進(jìn)行了試驗(yàn)，均證實(shí)芽胞桿菌屬為雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群，并在國(guó)內(nèi)外雪茄外包皮中分離鑒定出了枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽胞桿菌（Bacillus megaterium）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides）和解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefa?ciens）等細(xì)菌。其中蠟樣芽胞桿菌為食源性條件下的致病菌，廣泛存在于土壤、水、空氣和動(dòng)植物體中，當(dāng)蠟樣芽胞桿菌量大于1×105CFU/g時(shí)，該菌能產(chǎn)生大量腹瀉型腸毒素和致嘔吐型腸毒素，從而引起人或動(dòng)物中毒［6-8］。而目前有關(guān)雪茄煙葉中蠟樣芽胞桿菌的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，有必要建立有效的檢測(cè)方法對(duì)雪茄煙葉蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。

國(guó)內(nèi)外食品和飼料行業(yè)出臺(tái)了蠟樣芽胞桿菌的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，如ISO 7932∶2004［9］、GB 4789.14—2014［10］和美國(guó)FDA官方檢測(cè)方法［11］等，這些方法均采用甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂（MYP）培養(yǎng)基對(duì)蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行初步分離鑒定，然而芽胞桿菌屬為雪茄煙葉菌群中的優(yōu)勢(shì)菌屬，蕈狀芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌和巨大芽胞桿菌等同屬細(xì)菌的形態(tài)特征、生理生化特征與蠟樣芽胞桿菌相似，其具有極高的DNA同源性［12］。而MYP培養(yǎng)基選擇性不強(qiáng)，易受到能產(chǎn)生卵磷脂酶或發(fā)酵甘露醇的其他芽胞桿菌和葡萄球菌等背景菌的干擾，且卵磷脂沉淀環(huán)易發(fā)生擴(kuò)散重疊和交連，給計(jì)數(shù)和鑒定造成一定困難［13-15］。一般情況下需再進(jìn)行分離培養(yǎng)、鏡檢觀察、生化鑒定等，整個(gè)過(guò)程至少需要3～5 d，操作復(fù)雜且費(fèi)力，不能滿足微生物快速準(zhǔn)確檢測(cè)的需要［15］。隨著微生物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，顯色培養(yǎng)基利用目標(biāo)菌中特異性酶水解培養(yǎng)基中顯色底物使菌落體顯色，較傳統(tǒng)選擇培養(yǎng)基的特異性和選擇性更強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于微生物的快速檢測(cè)［16］。張淑紅等［13］和滕昆侖等［15］分別研制了蠟樣芽胞桿菌顯色培養(yǎng)基，并對(duì)食品中蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)效果進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。然而，煙葉基質(zhì)和菌群結(jié)構(gòu)與食品差異較大，顯色培養(yǎng)基的適用性需進(jìn)行驗(yàn)證。為此，采用一種新型的蠟樣芽胞桿菌顯色培養(yǎng)基——COMPASS?顯色培養(yǎng)基［17］，驗(yàn)證其在雪茄煙葉中蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)的適宜性，并對(duì)比分析COMPASS培養(yǎng)基和傳統(tǒng)MYP培養(yǎng)基的選擇性、特異性和靈敏度，評(píng)價(jià)COMPASS顯色培養(yǎng)基法和ISO 7932兩種方法對(duì)雪茄煙葉樣品中蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)效果，旨在找到一種快速分離和培養(yǎng)出雪茄煙葉中蠟樣芽胞桿菌，并能進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的方法。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

24份雪茄煙葉原料樣品分別來(lái)自5個(gè)國(guó)家，其中1#～3#、7#、11#和12#產(chǎn)地國(guó)為古巴，4#、15#和16#的產(chǎn)地為多米尼加，5#、8#～10#、13#、14#和19#產(chǎn)地為印度尼西亞，17#和18#產(chǎn)地為巴西，其他樣品產(chǎn)地為中國(guó)。

目標(biāo)菌株：蠟樣芽胞桿菌［CMCC（B）63303］；非目標(biāo)菌株：短小芽胞桿菌［Bacillus pumilus,CMCC（B）63202］、解淀粉芽胞桿菌（AS1.892）、枯草芽胞桿菌（ATCC 6633）、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis,AS1.788）、蕈狀芽胞桿菌（ATCC 6462）、巨大芽胞桿菌（ACCC 11107）、大腸桿菌（Escherichia coli,ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa,ATCC 27853）、腸道沙門(mén)氏菌腸道亞種鼠傷寒血清型［Salmonella entericasubsp.entericaserovar Typhimurium,ATCC 14028］、多黏類(lèi)芽胞桿菌（Paenibacillus polymyxa,ATCC 7047）、屎 腸 球 菌（Enterococcus faecium,ATCC 19434）、塞 氏 檸 檬 酸 桿 菌（Citrobacter sedlakii,ATCC 51115）、鮑 曼 不 動(dòng) 桿 菌（Acinetobacter baumnnii,ATCC 19606）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae,ATCC 13047）、緩慢葡萄球菌（Staphylococcus lentus,ATCC 700403）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii,ATCC 43864）、表皮葡萄球菌［Staphylococcus epidermidis,CMCC（B）26069］共18株標(biāo)準(zhǔn)菌株；蠟樣芽胞桿菌凍干定量質(zhì)控菌株（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，Q-Strain103系列，菌含量110~1 100 CFU/瓶）。

1.2 培養(yǎng)基

甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂即用型平板（MYP）、胰酪胨大豆羊血瓊脂即用型平板（TSSB）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；COMPASS顯色培養(yǎng)基基礎(chǔ)、COMPASS顯色培養(yǎng)基補(bǔ)充劑（法國(guó)Biokar公司）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、硫酸錳營(yíng)養(yǎng)瓊脂、蠟樣芽胞桿菌干制生化鑒定試劑盒（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；革蘭氏染色試劑盒（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 特異性和選擇性試驗(yàn)

取1株蠟樣芽胞桿菌和18株非目標(biāo)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇后，用1μL接種環(huán)取1環(huán)劃線接種至MYP和COMPASS平板上，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)［17］進(jìn)行制備，觀察各試驗(yàn)菌株在平板上的菌落顏色和形態(tài)特征，并比較兩種培養(yǎng)基的特異性。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.28—2013［18］進(jìn)行培養(yǎng)基的選擇性驗(yàn)證，將19株復(fù)蘇后的標(biāo)準(zhǔn)菌株在MYP和COMPASS平板進(jìn)行半定量劃線，每種培養(yǎng)基2個(gè)平行試驗(yàn)，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后觀測(cè)，若每條劃線均有較稠密菌落生長(zhǎng)則生長(zhǎng)指數(shù)（G）為1；僅一半的劃線有菌落稠密生長(zhǎng),G為0.5；劃線上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)、生長(zhǎng)量低于劃線的一半或菌落生長(zhǎng)微弱，G為0。計(jì)算每個(gè)平板的得分總和，求得平均值后即得到G值。

1.3.2 靈敏度試驗(yàn)

在蠟樣芽胞桿菌凍干定量質(zhì)控菌株中添加1.1 mL復(fù)蘇液，振蕩使充分溶解混勻，得到100～1 000 CFU/mL的菌懸液。取該菌懸液0.1 mL并加入到0.9 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液中混勻，得到10～100 CFU/mL的菌懸液。再將這兩種菌懸液分別取0.1 mL涂布至營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、MYP和COMPASS平板上，每種培養(yǎng)基3次平行試驗(yàn)。在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌落數(shù)量和形態(tài)。

1.3.3 人工污染樣品檢測(cè)

純陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株人工污染樣品檢測(cè)：準(zhǔn)確稱取25 g經(jīng)121℃、20 min滅菌處理的雪茄煙葉樣品于均質(zhì)袋中，加入225 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液進(jìn)行均質(zhì)處理，得到無(wú)菌樣品均質(zhì)液。取1 mL 100～1 000 CFU/mL的蠟樣芽胞桿菌懸液加入到9 mL的無(wú)菌均質(zhì)液內(nèi)，得到10～100 CFU/mL菌懸液，再將其稀釋至5～50 CFU/mL，然后分別取1 mL接種至MYP和COMPASS培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基3次平行試驗(yàn)。在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)24 h。

混合菌液人工污染樣品檢測(cè)：將蠟樣芽胞桿菌和至少在1種培養(yǎng)基中可生長(zhǎng)的6株代表性非目標(biāo)菌株（短小芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和屎腸球菌）復(fù)蘇后，各用1μL接種環(huán)取1環(huán)加入至9 mL無(wú)菌樣品均質(zhì)液中，充分研磨搖勻，按10倍濃度梯度稀釋至1×10-3、1×10-4、1×10-5，取各梯度稀釋液1 mL接種至MYP和COMPASS培養(yǎng)基上。每個(gè)稀釋度3次平行試驗(yàn)，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)24 h。觀察目標(biāo)菌的檢出和非目標(biāo)菌的干擾情況。

1.3.4 雪茄煙葉樣品檢測(cè)

無(wú)菌操作條件下準(zhǔn)確稱取25 g雪茄煙葉樣品至均質(zhì)袋中，加入225 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液后進(jìn)行均質(zhì)，將樣品勻液依次稀釋并制成1×10-2、1×10-3梯度稀釋液，分別采用ISO 7932方法和COMPASS方法進(jìn)行檢驗(yàn)。每個(gè)稀釋度3次平行試驗(yàn)，并置于30℃條件下培養(yǎng)24 h，見(jiàn)圖1。其中ISO 7932方法計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)后，需挑取計(jì)數(shù)平板上5個(gè)典型菌落（小于5個(gè)則全選）進(jìn)行純培養(yǎng)，再劃線接種至TSSB培養(yǎng)基上進(jìn)行確證，觀察溶血反應(yīng)，在MYP平板上典型菌落呈現(xiàn)微粉紅色，周?chē)邪咨恋奂t色沉淀環(huán)。而COMPASS方法無(wú)需進(jìn)行純化和確證實(shí)驗(yàn)，直接計(jì)數(shù)直徑大于1 mm（涂布接種）或大于0.5 mm（傾注接種）的綠色菌落。

圖1 ISO 7932和COMPASS方法的檢驗(yàn)程序Fig.1 Detection procedures of the ISO 7932 method and the COMPASS method

1.3.5 鑒定確證

1#～7#雪茄煙葉樣品檢測(cè)過(guò)程中從每個(gè)MYP和COMPASS平板上至少挑取5個(gè)菌落（少于5個(gè)全選）劃線接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行純培養(yǎng)后，挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落，依據(jù)文獻(xiàn)［19］的方法，采用革蘭氏染色鏡檢、動(dòng)力、硝酸鹽還原、甘露醇產(chǎn)酸、溶菌酶耐性、V-P反應(yīng)、葡萄糖利用（厭氧）、根狀生長(zhǎng)、溶血（羊紅細(xì)胞）和蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶等試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22軟件對(duì)典型菌落計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行均值t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 特異性分析

試驗(yàn)菌株在兩種培養(yǎng)基上的形態(tài)描述和圖片分別見(jiàn)表1和圖2，菌株在兩種培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出不同的菌落形態(tài)和顏色。在MYP培養(yǎng)基上，蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌呈現(xiàn)粉紅色或淡粉紅色，周?chē)杂邪咨恋奂t色沉淀環(huán)，三者較難區(qū)分。短小芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、多黏類(lèi)芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌和屎腸球菌共9株細(xì)菌皆能生長(zhǎng)，且能產(chǎn)生黃色或乳白色沉淀環(huán)，這可能與其含有葡萄糖苷酶有關(guān)［14］，但與蠟樣芽胞桿菌典型菌落顏色和形態(tài)特征存在明顯區(qū)別。大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、塞氏檸檬酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、緩慢葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和陰溝腸桿菌共7株細(xì)菌在MYP培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)。而在COMPASS培養(yǎng)基上，2株蠟樣芽胞桿菌呈直徑大于1 mm的綠色菌落，蘇云金芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌形態(tài)和顏色特征相似，綠色顯色物質(zhì)沉淀在菌落上未發(fā)生擴(kuò)散，較容易觀察計(jì)數(shù)。而屎腸球菌的形態(tài)和顏色與蠟樣芽胞桿菌有明顯區(qū)別，其他16株非目標(biāo)菌無(wú)菌落生長(zhǎng)?？梢?jiàn)，與MYP培養(yǎng)基相比，COMPASS培養(yǎng)基特異性更強(qiáng)。

表1 兩種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)比較Tab.1 Colony morphologies of tested strains in two media

圖2 兩種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)比較Fig.2 Colony morphologies of tested strains in two media

2.2 選擇性分析

兩種培養(yǎng)基的選擇性結(jié)果見(jiàn)表2，COMPASS培養(yǎng)基選擇性優(yōu)于MYP培養(yǎng)基。目標(biāo)菌株在兩種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)指數(shù)（G值）均大于6，且呈現(xiàn)典型的生長(zhǎng)形態(tài)，根據(jù)GB 4789.28—2013［18］這兩種培養(yǎng)基是可以接受的，而18種非目標(biāo)菌株在COMPASS和MYP培養(yǎng)基的G值均不大于6，說(shuō)明其在兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)受到不同程度的抑制。在COMPASS培養(yǎng)基上，除蘇云金芽胞桿菌和屎腸球菌以外，其他16種非目標(biāo)菌株皆被完全抑制（G=0），抑制率達(dá)88.9%（16/18）。對(duì)于MYP培養(yǎng)基，G值為0的非目標(biāo)菌株僅占38.9%（7/18），而6株非目標(biāo)芽胞桿菌的G值均大于0，其中解淀粉芽胞桿菌的G值為6.0，說(shuō)明未被完全抑制?？梢?jiàn)，COMPASS培養(yǎng)基的選擇性明顯優(yōu)于MYP培養(yǎng)基。

表2 試驗(yàn)菌株在兩種培養(yǎng)基上的選擇性比較Tab.2 Selectivity of tested strains in two media

2.3 靈敏度分析

MYP、COMPASS和NA培養(yǎng)基3種平板上接種10～100 CFU和1～10 CFU兩個(gè)水平的菌落數(shù)見(jiàn)表3。t檢驗(yàn)結(jié)果表明,在同一接種量水平下，MYP、COMPASS和NA平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)量差異不顯著（P>0.05），說(shuō)明MYP和COMPASS兩種選擇性培養(yǎng)基不會(huì)影響目標(biāo)菌的菌落數(shù)量。同時(shí)，從1～10 CFU接種水平來(lái)看，3種培養(yǎng)基之間的靈敏度相當(dāng)，檢測(cè)靈敏度都可達(dá)到1～10 CFU。

表3 試驗(yàn)菌株在3種培養(yǎng)基上的靈敏度比較①Tab.3 Sensitivities of tested strains in three media（CFU）

2.4 人工污染樣品檢測(cè)分析

2.4.1 純陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株人工污染樣品

經(jīng)純陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株人工污染處理后的雪茄煙葉樣品，在兩種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見(jiàn)圖3。在COMPASS培養(yǎng)基上，菌株呈典型生長(zhǎng)，菌落呈圓形或近似圓形，不透明綠色，似熔蠟狀，直徑大于1 mm；在MYP培養(yǎng)基上，均呈微粉色帶暈圈，說(shuō)明雪茄煙葉基質(zhì)顏色未影響蠟樣芽胞桿菌的典型菌落形態(tài)特征。兩種培養(yǎng)基上菌落計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表4，在同一接種水平和雪茄煙葉基質(zhì)環(huán)境下，MYP和COMPASS培養(yǎng)基目標(biāo)菌落數(shù)量差異不顯著（P>0.05）,說(shuō)明雪茄煙葉成分未能抑制MYP和COMPASS培養(yǎng)基目標(biāo)菌落的生長(zhǎng)。

表4 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株人工污染樣品在兩種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)量比較Tab.4 Number of colonies for artificially contaminated positive standard strain in two media （CFU）

圖3 人工污染樣品在兩種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)比較Fig.3 Colony morphologies of artificially contaminated samples in two media

2.4.2 混合菌株人工污染樣品

蠟樣芽胞桿菌和6株非目標(biāo)菌株混合污染樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。t檢驗(yàn)結(jié)果表明，在同一接種水平下兩種培養(yǎng)基間菌落數(shù)存在顯著差異（P＜0.05）。造成差異的原因可能是非目標(biāo)菌株對(duì)培養(yǎng)基檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，特別是短小芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌等非目標(biāo)芽胞桿菌屬菌株均能使MYP培養(yǎng)基中卵黃分解而產(chǎn)生暈環(huán)，致使發(fā)生接合生長(zhǎng)［14］，干擾目標(biāo)菌數(shù)量的計(jì)數(shù)。

2.5 雪茄煙葉實(shí)際樣品檢測(cè)分析

2.5.1 兩種方法比較

采用ISO 7932和COMPASS兩種方法同時(shí)檢測(cè)7份雪茄煙葉中蠟樣芽胞桿菌，所得計(jì)數(shù)結(jié)果及其對(duì)數(shù)值見(jiàn)表6。兩個(gè)方法檢測(cè)結(jié)果處于同一數(shù)量級(jí)內(nèi)，數(shù)量基本一致，t檢驗(yàn)結(jié)果表明COMPASS與ISO 7932方法的實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果差異不顯著（P>0.05），且COMPASS方法通過(guò)直接觀察菌落顏色形態(tài)就可對(duì)蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行快速計(jì)數(shù)，特別是對(duì)陰性樣品和污染較輕的樣品在24 h內(nèi)可報(bào)告結(jié)果，縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。

表6 兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果比較Tab.6 Detection results by two methods

同一樣品相同稀釋度涂布接種兩種平板培養(yǎng)后典型菌落見(jiàn)圖4，MYP平板由于雜菌過(guò)度生長(zhǎng)，使目標(biāo)菌被遮擋，出現(xiàn)了蔓延情況，且雜菌的顏色和形態(tài)會(huì)對(duì)典型菌落計(jì)數(shù)造成較大影響，導(dǎo)致判讀困難，無(wú)法計(jì)數(shù)。而COMPASS平板上綠色菌落清晰可見(jiàn)，較易判讀和計(jì)數(shù)。COMPASS培養(yǎng)基內(nèi)含的顯色底物被蠟樣芽胞桿菌中特征性酶水解，所含的選擇性抑菌劑可抑制其他芽胞桿菌（如巨大芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌等）和非芽胞桿菌的生長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)選擇性分離的目的，無(wú)需進(jìn)行純培養(yǎng)、革蘭氏染色和生化鑒定等步驟。因此，COMPASS方法替代ISO 7932方法對(duì)雪茄煙葉蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)是可行的。

圖4 實(shí)測(cè)樣品在兩種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)比較Fig.4 Colony morphologies of actual samples in two media

2.5.2 鑒定確證

在上述7份雪茄煙葉樣品檢測(cè)過(guò)程中，從MYP平板上共挑取92個(gè)典型菌落進(jìn)行生理生化鑒定，確證為陽(yáng)性的有87個(gè)，陽(yáng)性檢出率為94.6%（87/92）；從COMPASS平板上共挑取85個(gè)典型菌落進(jìn)行生化鑒定，被確證陽(yáng)性共82個(gè)，陽(yáng)性檢出率為96.4%（82/85）。說(shuō)明MYP和COMPASS培養(yǎng)基陽(yáng)性率已達(dá)到較高水平，而COMPASS培養(yǎng)基準(zhǔn)確性更高，假陽(yáng)性率更低。從10項(xiàng)鑒定試驗(yàn)結(jié)果看，蘇云金芽胞桿菌是最難區(qū)分的一種假陽(yáng)性菌，其在MYP和COMPASS培養(yǎng)基皆不能與蠟樣芽胞桿菌區(qū)分，而蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)是證實(shí)假陽(yáng)性的最有效手段。

2.5.3 實(shí)際樣品檢測(cè)分析

COMPASS法檢測(cè)實(shí)際雪茄煙葉樣品的結(jié)果見(jiàn)表7。在采集的24份樣品中，共檢出蠟樣芽胞桿菌陽(yáng)性樣品20份，檢出率達(dá)83.3%，這可能與蠟樣芽胞桿菌耐熱的生物學(xué)特性有關(guān)，其游離芽胞能在100℃時(shí)耐受30 min，在調(diào)制后煙葉中仍能存活。從檢出數(shù)值來(lái)看，檢出值范圍為1.0×10～1.3×104CFU/g，其中有2個(gè)和4個(gè)樣品菌含量分別達(dá)到104和103數(shù)量級(jí)。從各產(chǎn)地分析，發(fā)現(xiàn)古巴的煙葉樣品中蠟樣芽胞桿菌平均含量最高，其后依次為多米尼加、中國(guó)、印度尼西亞和巴西。

表7 雪茄煙葉樣品COMPASS方法的檢測(cè)結(jié)果Tab.7 Detection results of cigar tobacco leaf samples by the COMPASS method

蠟樣芽胞桿菌致病風(fēng)險(xiǎn)與其含量密切相關(guān)，當(dāng)食品中蠟樣芽胞桿菌大于1×105CFU/g時(shí)，該菌能產(chǎn)生大量腹瀉型腸毒素和致嘔吐型腸毒素，從而引起食物中毒［7,12］。雖然24個(gè)雪茄煙葉樣品檢出值皆低于澳大利亞和新西蘭、英國(guó)等國(guó)對(duì)蠟樣芽胞桿菌在即食食品中1×105CFU/g的限量規(guī)定［20］，但雪茄與食品的消費(fèi)方式不同，其檢出率和檢出值在一定程度上提示雪茄煙葉中仍存在蠟樣芽胞桿菌的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

通過(guò)COMPASS和ISO 7932兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)：①COMPASS培養(yǎng)基在選擇性、特異性和靈敏度方面優(yōu)于ISO 7932使用的MYP培養(yǎng)基；②COMPASS方法較省時(shí)且簡(jiǎn)便；③COMPASS方法與ISO 7932在檢測(cè)結(jié)果上無(wú)顯著差異。因此，COMPASS方法可作為ISO標(biāo)準(zhǔn)方法的有效替代方法，用于雪茄煙葉樣品蠟樣芽胞桿菌的快速檢測(cè)。