李燕梅 郝金平 郭永林 程環(huán)

(1菏澤市立醫(yī)院，山東 荷澤 274000；2菏澤市婦幼保健院)

銅綠假單胞菌(PA)因其生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生綠色水溶性色素，使膿液呈現(xiàn)綠色，因此又稱其為綠膿桿菌〔1〕。PA主要存在于人體的皮膚、呼吸道及消化道內(nèi)，其生長(zhǎng)條件要求較低，繁殖能力較強(qiáng)，因此會(huì)導(dǎo)致人體多系統(tǒng)、多部位和多臟器發(fā)生感染，嚴(yán)重時(shí)危及患者生命安全〔2〕。PA是造成肺炎的主要致病菌種，由該種病菌感染的肺炎致死率較高。PA肺炎是呼吸內(nèi)科常見(jiàn)疾病，但因PA的膜通透性較高而對(duì)多種抗生素耐藥，給臨床治療PA肺炎帶來(lái)了很大的困難〔3〕。磷酸肌醇3激酶(PI3K)/AKT是細(xì)胞進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)的重要途徑，涉及炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答〔4〕。Yang等〔5〕研究表明抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可阻止甲型流感病毒感染后的肺炎鏈球菌再感染；Yu等〔6〕研究顯示，廣藿香醇通過(guò)抑制PI3K/AKT和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路抑制了甲型流感病毒的體外繁殖，同時(shí)通過(guò)鼻內(nèi)給藥可顯著減輕肺炎小鼠的癥狀并提升肺炎小鼠的存活率?？寺寮盒赂苫鞈覄┦怯甥}酸溴己新和頭孢克洛復(fù)合而成的新制劑，其在抗感染、抗菌的基礎(chǔ)上進(jìn)行化痰治療?，F(xiàn)階段，克洛己新干混懸劑雖在臨床上取得了較好的治療效果，但對(duì)臨床用藥的安全性和其具體作用機(jī)制尚不清楚，因此本研究將在細(xì)胞水平上探究克洛己新干混懸劑的細(xì)胞毒性，并通過(guò)構(gòu)建PA肺炎動(dòng)物模型探究其治療效果和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑 60只雄性昆明小鼠，4周齡，體重(14.0±1.0)g，購(gòu)于國(guó)家藥品和生物制品控制研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，其中對(duì)照組12只，模型組48只。NHBE、BEAS-2B和A549細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所。克洛己新干混懸劑(編號(hào)：B14200032850，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20051142)購(gòu)自江蘇正大清江制藥有限公司。DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、瓊脂糖培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素及L-谷氨酰胺均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。人重組腫瘤壞死因子(TNF)-α細(xì)胞因子購(gòu)自以色列PEPROTECH公司。PA標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC27853)由菏澤市立醫(yī)院檢驗(yàn)中心提供。白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、TNF-α和RANTES酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自南京生航生物技術(shù)有限公司。PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和GAPDH一抗及HRP標(biāo)記的IgG二抗均購(gòu)自德國(guó)CST公司。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、RIPA裂解液和ECL試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) NHBE和BEAS-2B細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。A549細(xì)胞置于含10%胎牛血清和2 mmol/L L-谷氨酰胺的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建 NHBE、BEAS-2B和A549細(xì)胞以2×106個(gè)/ml分別接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞貼壁融合>50%時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，加入10 ng/ml的TNF-α刺激2 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3四甲基偶氨唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后配制成細(xì)胞懸液(5×104個(gè)/ml)并接種至96孔板，每孔180 μl。孵育過(guò)夜后加入0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 mg/ml的克洛己新干溶液。培養(yǎng)24 h后向各孔中加入10 μl的MTT溶液(5 g/L)繼續(xù)孵育4 h。棄除上清液后加入100 μl的DMSO振蕩10 min。使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm處的吸光光度值，并計(jì)算細(xì)胞活性。

1.2.4PA肺炎小鼠模型構(gòu)建 將標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853使用瓊脂糖培養(yǎng)基調(diào)整濃度至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?≈1.3×108CFU/ml)。切開(kāi)模型組小鼠氣管，注入含50 μl PA的瓊脂糖珠懸液后立即豎起小鼠保持2 min，菌液充分流入肺后小鼠有類似嗆咳反應(yīng)。對(duì)照組小鼠制作切口不接種PA。1 w后小鼠傷口愈合后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究中所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院關(guān)于對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的指導(dǎo)原則。

1.2.5小鼠實(shí)驗(yàn) 對(duì)照組小鼠傷口愈合后收集靜脈血，處死小鼠后收集小鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液(BALF)。模型組小鼠接種PA 1 w后通過(guò)口服克洛己新干混懸劑，根據(jù)口服克洛己新干混懸劑的劑量分為低濃度組〔10 mg/(kg·d)〕、中濃度組〔30 mg/(kg·d)〕和高濃度組〔50 mg/(kg·d)〕。口服克洛己新干混懸劑10 d，收集小鼠靜脈血后處死小鼠并收集肺組織和BALF。小鼠靜脈血收集后存于-20℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。小鼠BALF收集后測(cè)量其體積。將收集的小鼠肺組織稱重后置于80℃的恒溫干燥箱中過(guò)夜，獲取干燥的肺組織后稱重。通過(guò)公式計(jì)算小鼠肺組織濕/干重比(濕/干重比=濕肺重量/干肺重量)。

1.2.6ELISA檢測(cè)驗(yàn)證因子表達(dá)水平 向酶標(biāo)板各孔中加入稀釋后的IL-6、IL-8、TNF-α和RANTES抗原100 μl，置于37℃下4 h。棄除上清液后使用5%胎牛血清封閉40 min。加入對(duì)應(yīng)酶標(biāo)抗體后在按照ELISA試劑盒說(shuō)明書在450 nm處測(cè)定細(xì)胞、小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α和RANTES吸光光度值，根據(jù)各因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其水平。

1.2.7HE染色檢測(cè)小鼠肺組織病理學(xué)變化 將收集的小鼠肺組織使用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定48 h后使用梯度濃度的酒精脫水，隨后用石蠟進(jìn)行包埋。將石蠟包埋后的組織進(jìn)行切片(5 μm)后放置于載玻片上，在80℃的恒溫干燥箱中過(guò)夜。使用二甲苯去除組織表面的石蠟后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3 次，切片使用蘇木素染色液染色3 min后再使用伊紅染色液染色3 min。將染色后的切片風(fēng)干后使用中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察后拍照。

1.2.8Western印跡檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路活性 使用RIPA裂解液提取細(xì)胞和小鼠肺組織中的總蛋白。將30 μg的蛋白質(zhì)樣品使用SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，在室溫下使用脫脂奶粉封閉30 min。使用抗PI3K(1∶1 000)、抗p-PI3K(1∶1 000)、抗AKT(1∶1 000)、抗p-AKT(1∶1 000)和抗GAPDH(1∶1 000)在4℃條件下孵育過(guò)夜。孵育過(guò)夜后使用HRP標(biāo)記的IgG抗體繼續(xù)在室溫條件下孵育1 h。通過(guò)ECL試劑盒顯影后拍照，通過(guò)Imagej軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行測(cè)定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。使用Graphpad Prism8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖片繪制。

2 結(jié) 果

2.1克洛己新干混懸劑對(duì)人肺細(xì)胞和PI3K/AKT信號(hào)通路影響 MTT結(jié)果顯示，克洛己新干混懸劑濃度在0.1～3.0 mg/ml的濃度內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。通過(guò)TNF-α刺激A549細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。ELISA結(jié)果顯示，TNF-α誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)IL-6和IL-8的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組顯著上升(P<0.05)。高濃度組、中濃度組和低濃度組IL-6和IL-8水平均較TNF-α組明顯降低(P<0.05)。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，TNF-α誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路被激活(P<0.05)，高濃度組、中濃度組和低濃度組的克洛己新干混懸劑處理后細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路的激活受到明顯抑制(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)克洛己新干混懸劑對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路影響

表1 各組IL-6、IL-8水平比較

2.2PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)人肺細(xì)胞炎癥的影響 與TNF-α組相比，TNF-α+LY294002組p-PI3K、p-AKT信號(hào)通路蛋白顯著降低(均P<0.05)。見(jiàn)圖2，表2。表明使用LY294002后A549細(xì)胞內(nèi)IL-6和IL-8水平明顯降低。

圖2 Western印跡檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)人肺細(xì)胞炎癥的影響

表2 抑制PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)人肺細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的影響

2.3克洛己新干混懸劑對(duì)PA肺炎小鼠肺部炎癥和肺水腫的影響 HE染色結(jié)果顯示，接種PA后模型組小鼠肺組織中觀察到明顯的膿性滲出物，中濃度組、高濃度組克洛己新干混懸劑給藥10 d后可明顯減少PA肺炎小鼠肺組織的膿性滲出物，低濃度組克洛己新干混懸劑給藥并未表現(xiàn)出這種效果，見(jiàn)圖3。TNF-α組BLAF體積、濕重/干重、IL-6、IL-8、TNF-α、RANTES水平均顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)；低、中、高濃度組上述指標(biāo)水平均顯著低于TNF-α組，且至濃度依賴性(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

圖3 各組肺組織的病理學(xué)觀察(HE，×40)

表3 各組肺部炎癥和肺水腫影響指標(biāo)水平比較

2.4克洛己新干混懸劑對(duì)PA肺炎小鼠PI3K/AKT信號(hào)通路活性的影響 TNF-α組p-PI3K和p-AKT水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05);與TNF-α組相比，低濃度組、中濃度組、高濃度組p-PI3K和p-AKT水平顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)，見(jiàn)表4，圖4。

表4 克洛己新干混懸劑對(duì)PA肺炎小鼠PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的影響

圖4 克洛己新干混懸劑對(duì)PA肺炎小鼠PI3K/AKT信號(hào)通路活性的影響

3 討 論

研究表明，PA是院內(nèi)感染的主要病原體之一，其外毒素會(huì)抑制蛋白質(zhì)的合成，促使組織壞死，并引起白細(xì)胞減少、酸中毒、循環(huán)衰竭等，常發(fā)生在免疫力較為低下的人群中，同時(shí)也是造成肺炎的主要致病菌種〔7〕。同時(shí)PA誘發(fā)的肺炎是一個(gè)急性炎癥反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致肺損傷和一系列呼吸系統(tǒng)損傷，嚴(yán)重時(shí)可危及患者生命〔8〕。

PI3K/AKT信號(hào)通路在多種癌癥中發(fā)揮促癌作用〔9〕，在多種慢性疾病中發(fā)揮促炎作用〔10，11〕。研究顯示，miR-4485通過(guò)PI3K/AKT/mTOR途徑改善了H1N1誘發(fā)的肺部損傷〔12〕，另外Psg-1的缺乏會(huì)導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)通路激活誘發(fā)小鼠肺炎〔13〕。本研究結(jié)果表明PI3K/AKT信號(hào)通路參與了肺部細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。有研究表明，PA的鞭毛運(yùn)動(dòng)能夠激活PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，提示PI3K/AKT信號(hào)通路可能是PA誘發(fā)肺炎的重要途徑〔14〕。本研究表明克洛己新干可能通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路減輕PA誘導(dǎo)的肺炎小鼠的肺損傷。

臨床藥理學(xué)研究表明，服用克洛己新干混懸劑后可能對(duì)消化道、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)等產(chǎn)生一定的副作用〔15〕。但由于本研究實(shí)驗(yàn)室條件和時(shí)間限制，沒(méi)有研究口服克洛己新干混懸劑對(duì)小鼠的肝功能和消化系統(tǒng)功能的影響，因此在后續(xù)的研究中我們將著重探究克洛己新干混懸劑對(duì)小鼠肝功能和消化系統(tǒng)功能的影響。綜上，克洛己新干混懸劑可通過(guò)PI3K/AKT途徑在體外有效抑制炎癥細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)，也可通過(guò)PI3K/AKT途徑顯著降低PA肺炎小鼠的肺損傷和肺水腫情況，并顯著抑制PA肺炎小鼠血清炎癥因子的表達(dá)。