唐靜怡，段肖翠，范艷平，劉立立，李 靜，王健飛，史 平

動脈粥樣硬化(atheroselerosis， AS)是一種發(fā)生在大、中血管的慢性特異性炎癥[1]，可引發(fā)冠心病和腦梗死，其發(fā)病率和病死率均居各種疾病前列，是嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病之一[2]。臨床發(fā)現(xiàn)并確診冠狀動脈及腦血管病變檢查多為復(fù)雜及有創(chuàng)檢查，對儀器和操作者水平、經(jīng)驗(yàn)均要求較高，不利于臨床篩查。脂質(zhì)蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2, Lp-PLA2)是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型血管炎性因子，由動脈斑塊中的巨噬細(xì)胞分泌，并在相應(yīng)的病灶區(qū)呈高表達(dá)[3]。AS早期低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)在血管內(nèi)膜聚集并促進(jìn)白細(xì)胞黏附分子上調(diào)，與此同時在巨噬細(xì)胞集落刺激因子的誘導(dǎo)下，募集的單核細(xì)胞分化成為巨噬細(xì)胞，觸發(fā)炎癥反應(yīng)和斑塊形成[4]。近年研究亦證實(shí)Lp-PLA2與血管內(nèi)皮功能障礙有關(guān)，可能直接參與AS，增加冠心病風(fēng)險[5]。本研究探討Lp-PLA2與AS大鼠冠狀動脈疾病嚴(yán)重程度和穩(wěn)定性的關(guān)系，旨在為AS的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 100只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g ，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2017-0022，普通級，分20個籠子飼養(yǎng)，每籠5只。大鼠飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)動物學(xué)部屏障環(huán)境獨(dú)立通氣籠中，溫度控制在(25±1)℃，相對濕度控制在40%～60%，自由進(jìn)食水。

1.2藥物與試劑 阿托伐他汀(立普妥)購自北京嘉林藥業(yè)股份有限公司；維生素D3注射液購自上海通用藥業(yè)公司；膽固醇購自上海藍(lán)季科技發(fā)展公司；三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、LDL-C試劑盒均購自北京中生生物試劑公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；中性甲醛、乙醇、二甲苯購自天津科密歐有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 采用日本Olympus公司全自動生化分析儀；東莞市同創(chuàng)儀器有限公司光學(xué)顯微鏡；德國Leica公司切片機(jī)；湖南恒諾離心機(jī)有限公司低溫離心機(jī)；北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司BS-124s 型電子天平。

1.4分組、模型建立 將100只SPF級雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，健康組30只，模型1組35只，模型2組35只。模型1、2組造模方法及判定造模是否成功參考楊小蓉等[6]研究。模型1、2組均給予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料成分為基礎(chǔ)飼料76.5%、膽固醇3%、膽酸鈉0.5%、白糖5%、豬油10%、蛋黃粉5%，共飼養(yǎng)7周。模型1組造模初連續(xù)4 d給予維生素D320萬U/(kg·d)腹腔注射，模型2組一次性給予維生素D380萬U/kg腹腔注射。健康組給予普通飼料喂養(yǎng)并注射等量生理鹽水。本研究每組處死大鼠15只，取心臟主動脈瓣組織行HE染色，證實(shí)AS模型均制備成功[7]。

1.5藥物干預(yù) 模型1組、2組大鼠分別于造模成功后24 h使用阿托伐他汀5 mg/(kg·d)灌胃，健康組大鼠使用等量生理鹽水灌胃。給藥時間均為4周，給藥期間均使用普通飼料喂養(yǎng)。

1.6觀察指標(biāo)及方法

1.6.1主動脈粥樣硬化斑塊面積(PA)、血管管腔面積(LA)：分別于造模后和治療后，每組處死15只大鼠，將大鼠主動脈根用石蠟包埋，HE染色顯微鏡下拍照并使用Image-Pro Plus 圖像分析多次拍攝照片中的PA、LA，校正斑塊面積=PA/LA。

1.6.2大鼠血清TG、TC、LDL-C、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和Lp-PLA2含量：分別于造模后和治療后取大鼠血液0.5 ml，使用全自動生化分析儀檢測血清TG、TC、LDL-C和hs-CRP含量。使用Lp-PLA2試劑盒檢測血清Lp-PLA2含量，操作步驟及Lp-PLA2水平計(jì)算方式嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1大鼠體質(zhì)量比較 造模期間3組大鼠體質(zhì)量均呈增長趨勢。喂養(yǎng)1、4、5、6、7周3組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。喂養(yǎng)2、3周，模型1、2組大鼠體質(zhì)量高于健康組(P<0.05)；模型1、2組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 3組大鼠喂養(yǎng)7周體質(zhì)量變化情況模型1、2組均為AS模型，模型1組造模初連續(xù)4 d給予維生素D3 20萬U/(kg·d)腹腔注射，模型2組一次性給予維生素D3 80萬U/kg腹腔注射；AS為動脈粥樣硬化；與健康組比較，aP<0.05

2.2大鼠主動脈粥樣硬化PA、血管LA比較 與健康組比較，模型1、2組造模后及治療后大鼠血管LA均降低(P<0.05)。與造模后比較，治療后模型1、2組血管LA增加，主動脈粥樣硬化PA及PA/LA降低，但模型2組治療后血管LA低于模型1組，主動脈粥樣硬化PA及PA/LA高于模型1組(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠主動脈粥樣硬化PA及血管LA比較

2.3大鼠血清TG、TC、LDL-C含量比較 與健康組比較，造模后及治療后模型1、2組TG、TC、LDL-C含量升高，且模型2組高于模型1組(P<0.05)。與造模后比較，治療后模型1、2組TG、TC、LDL-C含量均顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 3組大鼠血清血脂水平比較模型1、2組均為AS模型，模型1組造模初連續(xù)4 d給予維生素D3 20萬U/(kg·d)腹腔注射，模型2組一次性給予維生素D3 80萬U/kg腹腔注射；TG為三酰甘油，TC為總膽固醇，LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇；與健康組比較，aP<0.05；與模型1組比較，bP<0.05；與造模后比較，cP<0.05

2.4大鼠血清Lp-PLA2活性及hs-CRP比較 與健康組比較，造模后及治療后模型1、2組Lp-PLA2活性、hs-CRP含量均顯著升高，且模型2組Lp-PLA2活性高于模型1組，hs-CRP含量低于模型1組(P<0.05)。與造模后比較，治療后模型1、2組大鼠Lp-PLA2活性及hs-CRP含量均顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 3組大鼠血清Lp-PLA2及hs-CRP水平比較模型1、2組均為AS模型，模型1組造模初連續(xù)4 d給予維生素D3 20萬U/(kg·d)腹腔注射，模型2組一次性給予維生素D3 80萬U/kg腹腔注射；Lp-PLA2為脂質(zhì)蛋白相關(guān)磷脂酶A2，hs-CRP為超敏C反應(yīng)蛋白；與健康組比較，aP<0.05；與模型1組比較，bP<0.05；與造模后比較，cP<0.05

3 討論

AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，快速建立有效的AS模型，是研究其確切發(fā)病機(jī)制的重要手段。目前建立AS模型方法包括喂養(yǎng)法、機(jī)械損傷法、免疫學(xué)方法、化學(xué)誘導(dǎo)法、轉(zhuǎn)基因法等[8]。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)配合不同方法注射維生素D3建立大鼠AS模型，比較符合人類飲食特點(diǎn)，同時死亡率也較低。楊小蓉等[6]研究指出多次、小劑量使用維生素D3(鈣離子誘導(dǎo)劑)能破壞動脈血管內(nèi)皮的完整性，利于血漿脂質(zhì)侵入并損傷血管壁；同時因鈣鹽沉積，平滑肌細(xì)胞變形，加速了動脈病變形成，從而建立AS模型，但多次注射時間較長，一次性大劑量注射維生素D3亦可快速誘導(dǎo)大鼠形成AS模型。本研究分別采用上述兩種方法制備AS模型，檢測其主動脈粥樣硬化PA、血管LA及各項(xiàng)血脂指標(biāo)，提示AS造模成功，與既往文獻(xiàn)一致[8-9]。

阿托伐他汀直接作用于血管緊張素轉(zhuǎn)化還原酶，抑制其活性，可降低患者血脂，改善血管內(nèi)皮功能，穩(wěn)定動脈血管斑塊，降低心腦血管事件發(fā)生風(fēng)險，臨床主要用于高膽固醇血癥、冠心病等的治療[10]。鄒行斌和黃鶴[11]報道，阿托伐他汀可以降低血清血脂及炎性因子水平，使大鼠主動脈粥樣硬化PA縮小，從而抑制AS發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，與健康組比較，模型1、2組造模后及治療后大鼠血管LA降低。與造模后比較，治療后模型1、2組血管LA增加，主動脈粥樣硬化PA及PA/LA降低。與模型1組比較,模型2組治療后血管LA降低，主動脈粥樣硬化PA及PA/LA升高，說明使用阿托伐他汀治療后大鼠AS病變得到了顯著改善，與徐臘生[12]研究結(jié)果一致。說明阿托伐他汀可以有效降低血脂，抑制AS進(jìn)展并改善患者癥狀[13-14]。

Lp-PLA2是磷脂酶A2家族的一個亞類，可以催化多種氧化磷脂Sn-2位上酯鍵水解，產(chǎn)生游離脂肪酸和溶血磷脂[15]。劉建輝和張春妮[16]報道，Lp-PLA2活性與其濃度相關(guān)，當(dāng)體內(nèi)Lp-PLA2濃度升高其活性也會隨之升高，同時TG、高密度脂蛋白膽固醇具有一定的活化該酶的作用。本研究結(jié)果顯示，與健康組比較，造模后及治療后模型1、2組TG、TC、LDL-C及Lp-PLA2含量顯著升高，且模型2組上述指標(biāo)高于模型1組。說明隨著AS大鼠體內(nèi)血脂水平增高，Lp-PLA2活性亦顯著升高，穩(wěn)定的AS模型大鼠體內(nèi)Lp-PLA2通過分解脂類物質(zhì)、促進(jìn)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致AS病變發(fā)展[17]。與造模后比較，治療后模型1、2組TG、TC、LDL-C及Lp-PLA2含量均顯著降低。說明當(dāng)大鼠體內(nèi)AS病變緩解后，Lp-PLA2氧化應(yīng)激水平也顯著降低，對機(jī)體血管損傷減輕。提示Lp-PLA2活性能夠準(zhǔn)確反映動脈粥樣斑塊炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激程度，與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致[18-19]。

hs-CRP是一種急性時相反應(yīng)蛋白，可以反映人體內(nèi)非特異性炎癥，其含量越高說明患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)越活躍[20]；粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定時，hs-CRP作為非特異性炎癥標(biāo)志物升高[21]，該指標(biāo)亦是衡量冠狀動脈病變程度及判斷預(yù)后的重要指標(biāo)[22-23]。毛海慧等[21]研究發(fā)現(xiàn)hs-CRP是高危斑塊的獨(dú)立危險因素。本研究結(jié)果顯示，與模型1組比較，模型2組造模后及治療后hs-CRP含量顯著降低，與既往文獻(xiàn)報道一致[24-25]。

綜上所述，血清Lp-PLA2水平能反映AS疾病嚴(yán)重程度和穩(wěn)定性，且隨著AS病變嚴(yán)重程度和不穩(wěn)定性增加而升高，可能與AS導(dǎo)致的炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。本研究證實(shí)了Lp-PLA2與AS大鼠疾病嚴(yán)重程度和穩(wěn)定性相關(guān)，本課題組將在后續(xù)研究中，進(jìn)一步使用Lp-PLA2抑制劑，探究降低Lp-PLA2是否可以改善AS相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)及癥狀。