陳衛(wèi)平，陳 夢，紀(jì)曉燕，盧光英，毛菊華，王偉影*

（1.麗水市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究院，浙江麗水 323000；2.浙江維康藥業(yè)股份有限公司，浙江麗水 323000）

金剛藤（菝葜）為百合科植物菝葜（Smilax china L.）的干燥根莖，具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹、解毒散瘀的功效，用于治療小便淋濁、帶下量多、風(fēng)濕痹痛、疔瘡癰腫[1]；以金剛藤獨(dú)一味藥材提取物制成的制劑金剛藤膠囊和金剛藤軟膠囊，具有清熱解毒、化濕消腫的功效，用于附件炎等婦科疾病的治療[2-3]。金剛藤藥材現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)缺少指標(biāo)性成分含量測定[1]，其獨(dú)一味制劑選用的指標(biāo)性成分為薯蕷皂苷元，含量測定方法存在前處理煩瑣、干擾組分較多等缺點(diǎn)[2-3]。為更好地控制金剛藤及其獨(dú)一味制劑的質(zhì)量，本試驗(yàn)在相關(guān)質(zhì)控方法研究和藥理活性研究的基礎(chǔ)上[4-12]，選取了落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素等5個活性、指標(biāo)性成分，采用HPLC波長切換法測定其在金剛藤藥材和制劑中的含量，以期為金剛藤藥材及其獨(dú)一味制劑的質(zhì)量評價和質(zhì)量控制提供一種普適方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；G4212B二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司）；電子天平（XPE105，瑞士梅特勒公司）；水浴鍋（KQ-250DE，昆山市超聲儀器有限公司）；超純水儀（DIRECT 8/16，美國密理博公司）。

1.2 試劑

落新婦苷對照品（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，批號：V7840010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.8%）；原兒茶酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110809-200604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：100.0%）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：96.8%）；白藜蘆醇對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110535-200301，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：100.0%）；山柰素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110861-201209，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：93.2%）；甲醇為色譜純（Merck）；乙腈為色譜純（Merck）；磷酸為色譜純（科密歐）；乙醇為分析純（杭州高晶精細(xì)化工有限公司）；水為自制純化水。

1.3 藥材及制劑

金剛藤藥材經(jīng)麗水市食品藥品與質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測院副主任中藥師王偉影鑒定，為百合科植物菝葜（Smilax china L.）的干燥根莖。金剛藤藥材及獨(dú)一味制劑均為市場購入（詳見表1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，柱溫為30℃；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，乙腈10%→15%；10～20 min，乙腈15%→25%；20～28 min，乙腈25%→30%；28～35 min，乙腈30%→40%；35～40 min，乙腈40%→50%；40～45 min，乙腈50%→70%；45～50 min，乙腈70%），流速為1.0 mL·min-1；柱溫35℃；檢測波長0～33 min為306 nm，33～50 min為365 nm；進(jìn)樣量：10μL，理論板數(shù)按落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇與山柰素計均不低于5000。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素對照品適量，分別加甲醇制成每1mL含落新婦苷543.41μg、原兒茶酸223.00μg、綠原酸573.06μg、白藜蘆醇218.60μg和山柰素201.00μg的溶液，作為儲備液。精密吸取5種儲備液置同一量瓶中，加甲醇制成每1mL分別含落新婦苷54.341μg、原兒茶酸22.300μg、綠原酸57.306μg、白藜蘆醇21.860μg和山柰素10.553μg的混合溶液，作為混合對照品溶液（已按各自質(zhì)量分?jǐn)?shù)折算）。

2.3 供試品溶液的制備

金剛藤供試品溶液的制備：稱取樣品粉末（過三號篩）2.0 g，精密稱定，加入70%乙醇100 mL，加熱回流提取1 h，取出放冷至室溫，以70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

金剛藤制劑的制備：稱取樣品內(nèi)容物2.0 g，精密稱定，加入70%乙醇100 mL，加熱回流提取1 h，取出放冷至室溫，以70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取“2.2、2.3”項(xiàng)下溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。在該色譜條件下，落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素與其他成分均可達(dá)到基線分離，理論塔板數(shù)均在8000以上，分離效果較好。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 線性關(guān)系、檢出限和定量限考察

精密吸取混合對照品溶液1、2、5、8、10μL，分別進(jìn)樣測定，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積（Y）對進(jìn)樣質(zhì)量（X，ng）進(jìn)行線性回歸；以信噪比為3時的質(zhì)量為檢出限，信噪比為10時的質(zhì)量為定量限，結(jié)果詳見表2。

表2 化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素峰面積的RSD分別為0.77%、1.62%、0.65%、0.83%、1.55%，結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取金剛藤軟膠囊，平行取樣6份，照“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，按干燥品計算供試品中落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素的含量分別為0.250 mg·g-1、0.196 mg·g-1、1.296 mg·g-1、0.101 mg·g-1、0.029 mg·g-1，RSD分別為1.13%、1.26%、0.89%、1.06%、1.32%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別在0、6、12、18、24、36 h進(jìn)樣，結(jié)果落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素峰面積的RSD分別為1.19%、1.35%、0.97%、1.08%、1.46%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的金剛藤軟膠囊6份，各約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素對照品儲備液溶液1.0 mL、1.8 mL、4.5 mL、1.0 mL、0.3 mL及70%乙醇91.4 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備回收率試液，按“2.1”色譜條件測定，測定落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素的含量，計算得回收率分別為100.02%、99.01%、100.16%、100.26%、99.56%，RSD分別為1.57%、1.06%、1.292%、1.12%、1.67%。

2.10 樣品含量測定結(jié)果

取各樣品約2.0 g，各3份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果見表3。

表3 金剛藤及其制劑中各成分的含量測定結(jié)果（mg·g-1，n=3）

3 討論

在參考相關(guān)研究的基礎(chǔ)上[8-12]，考察了甲醇-水和乙腈-水兩個系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-水系統(tǒng)加入少量磷酸分離效果較理想且峰形較佳、分析時間短。本文在預(yù)實(shí)驗(yàn)時選用4波長（260 nm、290 nm、330 nm和365 nm）同時測定5種成分，結(jié)合190～400 nm波段紫外掃描的結(jié)果，確定306 nm作為落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸和白藜蘆醇的檢測波長，365 nm作為山柰素的檢測波長，并選擇33 min為波長切換點(diǎn)，檢測波長由306 nm變成365 nm，使落新婦苷、原兒茶酸、綠原酸、白藜蘆醇和山柰素可以在同一色譜條件下測定，且色譜峰可以在同一色譜圖中呈現(xiàn)。此法不僅適用于DAD檢測器、雙波長紫外檢測器，也適用于普通的單波長紫外檢測器，具有普適性、便捷等優(yōu)點(diǎn)，可為金剛藤及其獨(dú)一味制劑質(zhì)量評價提供方法參考。

測定結(jié)果顯示：不同產(chǎn)地和不同企業(yè)的金剛藤獨(dú)一味制劑中5種成分含量差異較大；綠原酸為其中最穩(wěn)定、含量優(yōu)勢明顯的成分；山柰素在3個金剛藤藥材中均不能檢出，在2個獨(dú)一味制劑中均有檢出，含量差別近4倍；落新婦苷、原兒茶酸和白藜蘆醇在不同產(chǎn)地的金剛藤中差別較大，在兩個獨(dú)一味制劑中差別亦較大。各成分差異大，初步判斷可能與產(chǎn)地、采收時間有關(guān)，項(xiàng)目組在后續(xù)研究中將針對金剛藤產(chǎn)地和采收時間進(jìn)行研究。鑒于化合物的特征性和藥效活性，結(jié)合相關(guān)研究[8-12]，建議將落新婦苷、白藜蘆醇和綠原酸3種成分作為金剛藤及其獨(dú)一味質(zhì)量評價的指標(biāo)成分。