楊菱霞，丁雯雯，陸 潔，凌 鑫，余 強

（1. 蘇州市第九人民醫(yī)院消化內科，江蘇 蘇州 215200；2. 蘇州市第九人民醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇 蘇州 215200；3. 南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院消化內科，江蘇 蘇州 215002）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一［1］，其臨床表現(xiàn)主要為便血及排便習慣改變，常伴有腹部隱痛、貧血、便秘或腹瀉等情況［2］。上述癥狀不僅降低患者的生活質量和生存率，還給個人家庭乃至整個社會帶來巨大經濟負擔。CRC 的發(fā)病主要與飲食、生活方式、遺傳和環(huán)境等因素密切相關［3］。流行病學調查結果顯示，CRC 的發(fā)病率逐年上升且呈現(xiàn)年輕化趨勢［4，5］。預計2030 年，全球CRC 患者將增加60%以上［6］。手術切除是CRC 治療的主要方式，存在較高的復發(fā)風險，臨床常聯(lián)合化療藥物和中藥復方輔助治療［7］。研究發(fā)現(xiàn)，長期給予CRC 患者服用奧沙利鉑、阿司匹林等化療藥物多存在抑郁、焦慮、嗜睡、惡心、嘔吐等不良反應［8，9］。中藥具有多成分、多途徑、多靶點的功能，在降低藥物毒性和副作用等方面發(fā)揮著獨特的優(yōu)勢［10］。

CRC 屬 于 中 醫(yī)“泄 瀉”“積 聚”“臟 毒”等 范 疇，《景岳全書》認為凡遇怒氣便作瀉者多為肝脾不和，肝木克脾土，耗傷脾胃而致病?！鹅`樞·五變》指出“所愿不遂，肝氣郁結，氣機不暢，橫逆伐脾，脾失健運，而致邪實內積發(fā)為積聚”?！锻饪普凇づK毒論》提及情志異常易致脾胃受損，運化失司，濕毒內蓄，蓄久化熱，而形成腫瘤。故CRC 患者因癌久耗，脾胃虛弱，肝氣郁結，情志異常，多屬肝郁脾虛之證，其病機本虛標實。痛瀉要方首載于《醫(yī)考方》為治療肝郁脾虛證的經典名方，方中以白術為君以健脾補虛，白芍為臣以養(yǎng)血柔肝、緩急止痛，陳皮和防風為佐以理氣醒脾、升清止瀉，四者合用共達調和肝脾、祛濕止瀉之效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，痛瀉要方可通過改善機體炎癥及氧化應激反應，抵抗內質網應激誘導的細胞凋亡，下調5-HT 表達水平，糾正腸動力及腸分泌功能異常等方式發(fā)揮對消化系統(tǒng)的保護作用［11］。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，加味痛瀉要方可改善肝郁脾虛型CRC 患者的腹痛、便血、便秘和腹瀉交替出現(xiàn)的癥狀，提升患者的肛門收縮功能［12］。其與化療藥物聯(lián)合使用可有效降低化療導致的腹瀉、惡心、嘔吐等不良反應，提高患者免疫功能，起到減毒增 效 的 作 用［13，14］。但 目 前 痛 瀉 要 方 治 療CRC 的 分子機制和藥效物質基礎尚未完全闡明，或為其在臨床上廣泛應用的障礙之一。

網絡藥理學以高通量的方式從中藥復方中篩選出協(xié)同增效的化合物，具有“數(shù)據量大、分析便捷、結果準確”的特征。其與分子對接技術結合使用可有效地映射到目標化合物及潛在治療靶點，發(fā)揮對藥物-疾病-調控機制的預測作用。因此，本文擬通過網絡藥理學和分子對接的方式挖掘痛瀉要方治療CRC 的靶點和藥效物質，為進一步研究作用機制和藥物開發(fā)提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 活性化合物和靶點的收集

通過TCMSP 數(shù)據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），檢索“白術”、“白芍”、“陳皮”、“防風”四味中藥。本研究以藥代動力學參數(shù)中的口服生物利 用 度（oral bioavailability，OB）及 類 藥 性（drug-likeness，DL）為標準，設定OB≥30%，DL≥0.18 以篩選痛瀉要方中的活性化合物及預測活性化合物靶點。利用Uniprot 數(shù)據庫（https：//www.uniprot.org/）將靶點名稱統(tǒng)一標準化處理［15］，使用Cytoscape 3.7.2 軟件構建“活性化合物-靶點”網絡圖。

1.2 痛瀉要方中活性化合物治療CRC 作用靶點的收集

通 過MalaCards 數(shù) 據 庫（https：//www.malacards.org/）以“Colorectal cancer”為關鍵詞檢索CRC作用靶點［16］。將痛瀉要方中活性化合物相關靶點與CRC 作用靶點互相映射得到交集靶點，使用R 包VennDiagram 繪制痛瀉要方-CRC 相關靶點韋恩圖［17］。

1.3 生物學功能和通路分析

在DAVID 6.8 數(shù) 據 庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）中限定物種為“Homo sapiens”［18］，對痛瀉要方治療CRC 的作用靶點進行基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析［19］。使 用R 包ggplot2 繪 制GO 功 能 的 柱 狀 圖 和KEGG 通路的氣泡圖［20］。

1.4 中藥-活性化合物-CRC-靶點網絡構建

將痛瀉要方治療CRC 的中藥、活性化合物、靶點和疾病導入Cytoscape 3.7.2 軟件構建“中藥-活性化合物-CRC-靶點”網絡。使用Network Analysis插件對網絡節(jié)點進行拓撲參數(shù)分析，以Degree 值高低篩選痛瀉要方治療CRC 的核心活性化合物和核心靶點［21］。

1.5 核心靶點的數(shù)據庫驗證

通過THE HUMAN PROTEIN ATLAS 數(shù)據庫（https：//www.proteinatlas.org）對核心靶點的蛋白表達情況進行驗證，分別在PATHOLOGY 和TISSUE 模塊中下載CRC 患者和正常人關于核心靶點的無版權結直腸免疫組化圖片，并進行比對分析［22，23］。

1.6 核心活性化合物與核心蛋白受體的分子對接分析

從痛瀉要方治療CRC 作用靶點的相互作用網絡中選取Degree 值由高到低排序前3 的核心活性化合物和前3 的核心蛋白受體。通過RSCB PDB 數(shù)據庫（https：//www.rcsb.org/）選取相應靶點蛋白結構 并 下 載 其3D 結 構PDB 格 式 文 件［24］。在Pub-Chem 數(shù) 據 庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取核心活性化合物2D 結構的sdf 格式文件，并借助Chem Draw 軟件繪其化學結構式［25］。使用Pymol 軟件對原PDB 文件進行去除水和原配體處理，Autodock Tolls 軟件為靶蛋白受體分子加極性氫，通過Autodock Vina 和Python 腳本實現(xiàn)分子對接［26］。分子對接過程中其結合能越低代表受體與配體的親和力越好，本研究選取結合能≤－5.0 kJ/mol 的作為化合物與靶點有效結合的篩選依據［27］。

2 結果

2.1 痛瀉要方活性化合物和靶點的篩選結果

根據篩選條件從TCMSP 數(shù)據庫中收集白術活性化合物7 個，白芍活性化合物13 個，陳皮活性化合物5 個，防風活性化合物20 個，映射去重后共獲得該方的活性化合物42 個。經Uniprot 數(shù)據庫對靶點名稱進行統(tǒng)一標準化處理后發(fā)現(xiàn)痛瀉要方中有34 個活性化合物具有對應靶點，共對應114 個靶點。將篩選的活性化合物及靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件構建活性化合物-靶點網絡圖。圖中圓形表示靶點，V 形表示活性化合物，共包括148 個節(jié)點（114 個靶點和34 個化合物）和356 條邊。見圖1。

圖1 活性化合物-靶點網絡圖Fig 1 The network of diagram of active compounds-targets

2.2 痛瀉要方中活性化合物治療CRC 作用靶點交集結果

在MalaCards 數(shù)據庫中檢索到838 個CRC 相關的潛在靶點，將其與痛瀉要方對應的114 個靶點互相映射后得到52 個交集靶點，見圖2。

圖2 痛瀉要方-CRC 相關靶點韋恩圖Fig 2 Venn diagram of Tongxie Yaofang-CRC related targets

2.3 生物學功能和通路分析

GO 功能分析結果顯示，52 個交集靶點預測到1 410 個富集結果（P＜0.05）。其中包括生物過程（BP）1 256 個，主要富集于脂質代謝、激素反應、癌細胞增殖和凋亡等過程；細胞組成（CC）34 個，主要影響CRC 細胞線粒體膜電位、內質網應激；分子功能（MF）120 個，主要涉及氧化還原酶活性、蛋白激酶活性等，本研究分別依據P值大小篩選排名前20 位的BP、CC、MF 結果繪制柱狀圖，見圖3。

圖3 痛瀉要方治療CRC 的GO 功能柱狀圖Fig 3 GO function histogram of the key targets of Tongxie Yaofang in treatment of CRC

KEGG 分析結果顯示，52 個交集靶點共參與104 條信號通路過程（P＜0.05），主要涵蓋磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、Toll 樣受體（TLR）信號通路等，本研究依據P值大小篩選排名前20 位的信號通路繪制通路氣泡圖，見圖4。

圖4 痛瀉要方治療CRC 的KEGG 通路氣泡圖Fig 4 KEGG pathway enrichment bubble chart of the key targets of Tongxie Yaofang in treatment of CRC

2.4 痛瀉要方中活性化合物治療CRC 作用靶點的篩選結果

將痛瀉要方治療CRC 的中藥、活性化合物、靶點和疾病導入Cytoscape 3.7.2 軟件構建中藥-活性化合物-CRC-靶點網絡圖，見圖5。圖中三角形表示中藥，V 形表示中藥相應的活性化合物，圓形和綠色表示活性化合物對應的靶點，菱形和天藍色表示CRC，紫色表示白術和其相應的活性化合物，粉色表示白芍和其相應的活性化合物，橙色表示陳皮和其相應的活性化合物，淺紫色表示防風和其相應的活性化合物，棕色表示白芍和防風共同的活性化合物。網絡圖中共包括85 個節(jié)點（52 個靶點、28 個活性化合物、4 個中藥和1 個疾病）和248 條邊。其中，28 個活性化合物是通過痛瀉要方的活性化合物靶點與52個交集靶點映射篩選而來。通過Network Analysis插件對網絡圖分析發(fā)現(xiàn)，由Degree 值從高到低排序前3 名的核心活性化合物分別為MOL000173-漢黃芩素（wogonin）、MOL000422-山奈酚（kaempferol）、MOL000358-β-谷甾醇（beta-sitosterol），前3 名的核心靶點為PTGS2、PTGS1、ESR1。上述化合物和靶點與痛瀉要方治療CRC 的關聯(lián)性最強，見表1、2。

圖5 中藥-活性成化合物-CRC-靶點網絡圖Fig 5 The network of diagram of herbs-active compounds-targets

表1 中藥-活性化合物-CRC-靶點網絡中Degree 值較高的核心靶點Tab 1 The key targets with high Degree values in the network of herbs-active compounds-CRC

2.5 核心靶點的數(shù)據庫驗證結果

免疫組化結果顯示，CRC 組織中PTGS2、PTGS1、ESR1 呈現(xiàn)較強的陽性蛋白表達且主要集中在CRC 細胞的細胞質與細胞膜內，正常腸組織中PTGS2、PTGS1、ESR1 呈現(xiàn)較弱的陽性蛋白表達。

表2 中藥-活性化合物-CRC-靶點網絡中Degree 值較高的核心化合物Tab 2 The active compounds with high Degree values in the network of herbs-active compounds-CRC

2.6 核心活性化合物與核心靶點蛋白受體的分子對接結果

利用AutoDock Vina 軟件和Python 腳本，對中藥-活性化合物-CRC-靶點網絡中degree 值最高的3 個核心化合物（漢黃芩素、山奈酚、β-谷甾 醇）和3 個 核 心 靶 點 蛋 白（PTGS2、PTGS1、ESR1）進 行 分 子 對 接，其 中PTGS2、PTGS1、ESR1 靶 點 蛋 白 的PDB ID 分 別 為1pxx、1prh、1uom，活性化合物和靶點蛋白受體間的結合活性度越高，則兩者結合能越低。結果表明，3 個核心活性化合物與3 個核心靶點蛋白受體對接結果均小于≤－5.0 kJ/mol，其中漢黃芩素與PTGS2、PTGS1、ESR1 的 結 合 能 分 別 為－36.00、－30.98、－36.42 kJ/mol；山奈酚與PTGS2、PTGS1、ESR1 的結合能分別為－27.21、－27.21、－33.91 kJ/mol；β-谷 甾 醇 與PTGS2、PTGS1、ESR1的結合能分別為－23.02、－23.02、－33.91 kJ/mol；提示痛瀉要方核心活性化合物和CRC 核心靶點之間具有良好的結合能力。具體組合情況，見表3，圖8～10。

表3 核心化合物與核心靶點結合能Tab 3 Binding energies of key active compounds with core targets

圖8 Wogonin 與PTGS2、PTGS1、ESR1 分子對接圖（左為整體，右為細節(jié)）Fig 8 The molecular docking diagram of wogonin and PTGS2，PTGS1，ESR1（left：overall，right：detail）

圖9 Kaempferol 與PTGS2、PTGS1、ESR1 分子對接圖（左為整體，右為細節(jié)）Fig 9 The molecular docking diagram of Kaempferol and PTGS2，PTGS1，ESR1（left：overall，right：detail）

圖10 beta-Sitosterol 與PTGS2、PTGS1、ESR1 分子對接圖（左為整體，右為細節(jié)）Fig 10 The molecular docking diagram of beta-Sitosterol and PTGS2，PTGS1，ESR1（left：overall，right：detail）

3 討論

CRC 是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，可嚴重影響患者的生活質量。痛瀉要方在治療CRC 方面具有減毒增效的作用，但其具體分子機制和藥效物質尚未完全闡明。目前，網絡藥理學和分子對接技術已開始規(guī)?；瘧糜谥兴幓钚曰衔锖Y選及關鍵靶點對接等領域，為初步探尋痛瀉要方治療CRC 的作用規(guī)律提供了可能。本研究通過網絡藥理學獲取了痛瀉要方治療CRC 的28 個活性化合物和52 個靶點，并借助GO 功能富集分析、KEGG 通路富集分析、構建中藥-活性化合物-CRC-靶點網絡及關鍵靶點驗證等方式，從整體上展示了二者間的分子作用關系及涵蓋的信號通路情況。

GO 功能富集分析提示，痛瀉要方干預CRC 可能與加速機體脂質代謝、激素反應、癌細胞增殖和凋亡、線粒體膜電位、內質網應激、氧化還原酶活性和蛋白激酶活性等條目密切相關。其中，CRC 的發(fā)病與患者機體內脂質代謝異常存在高度關聯(lián)性，脂肪細胞可通過分泌激素、促炎因子等介質，加速CRC 細胞的增殖和轉移速率［28］。激活蛋白酶活性能夠有效降低CRC 細胞（HCT116 和HCT8）的活性氧含量、線粒體膜電位和內質網應激反應，進而導致癌細胞凋亡［29］。

KEGG 通路富集提示，痛瀉要方干預CRC 可能與PI3K/AKT 信號通路、TNF 信號通路、TLR 信號通路密切相關。其中，大多數(shù)CRC 患者發(fā)病過程中伴有PI3K/AKT 信號通路異常且PI3K/Akt 信號抑制劑被認為是有效的CRC 治療劑［30］。PI3K/AKT信號通路能夠調控關鍵miRNA 的轉錄表達，增強對CRC 細胞增殖、遷移的抵抗功能［31］。TNF 家族成員可影響CRC 患者的疾病發(fā)展進程和預后情況［32］。CRC 臨床常用化療藥物5-氟尿嘧啶能夠通過抑制TNF 信號通路，達到降低結腸癌干細胞的增殖和轉移能力的目的［33］。TLR 信號傳導在激活固有免疫和適應性免疫從而調節(jié)機體炎癥反應中起關鍵性作用，其信號傳導失調可誘導CRC 患者產生IL-1β、TNFα、IL-6 等炎癥因子，導致上皮層止血功能紊亂，進而加快CRC 的進程［34］。調控TLR2 可有效抑制CRC 細胞增殖和上皮間質轉化，進一步降低癌細胞的遷移和侵襲能力［35］。

中藥-活性化合物-CRC-靶點網絡分析發(fā)現(xiàn)，痛瀉要方治療CRC 的主要活性化合物屬漢黃芩素、山奈酚、β-谷甾醇等，主要作用靶點為PTGS2、PTGS1、ESR1 等。其中，漢黃芩素為一種類黃酮化合物，具有廣泛的生物學作用，可顯著抑制人結腸癌細胞（HCT-116）的增殖效率，促使DNA 片段化及染色質濃縮［36］。山奈酚同屬一種常見的類黃酮化合物，大量存在于蔬菜和水果中，常被用于癌癥的化療過程中［37］。其可通過調控PI3K/Akt 信號通路，使癌細胞周期停滯在G2 /M 期來實現(xiàn)防治CRC的作用［38］。β-谷甾醇作為一種植物甾醇，可發(fā)揮抑制炎癥及氧化應激反應，誘導細胞凋亡等作用［39］。β-谷甾醇常用作CRC 患者化療期間的輔助藥物，其主要通過抑制MDM2-p53 信號通路，進而提高抗癌藥物OXA 的療效及降低其不良反應的發(fā)生率［40］。前列腺素內過氧化物合酶（PTGS）又稱環(huán)氧合酶（COX），其包括誘導型PTGS2（COX-2）和組成型PTGS1（COX-1）。HCT116 和HT29 經COX-1 基因沉默后可誘導細胞內線粒體膜電位去極化，抑制三磷酸腺苷的產生，增加活性氧的含量，導致癌細胞 凋 亡［41］。通 過 分 析CRC 組 織 標 本 提 示，超 過80%的CRC 組織中呈現(xiàn)COX-2 中、高度陽性表達，主要存在染色質狀態(tài)的異質性［42］。人體腸道內ESR1 單核苷酸多態(tài)性與CRC 的易感性和疾病嚴重程度存在密切關聯(lián)［43］。ESR1 在CRC 組織中的表達水平顯著高于正常的結直腸組織［44］，給予CRC 患者5-FU 治療后可顯著降低患者癌組織中ESR1 mRNA 的表達水平及無病生存期［45］。

此外，上述結果在THE HUMAN PROTEIN ATLAS 數(shù)據庫及藥物-靶點分子對接中得以驗證。其中，免疫組化結果提示CRC 組織與正常腸組織相比PTGS2、PTGS1、ESR1 呈現(xiàn)較強的陽性蛋白表達；分子對接結果提示痛瀉要方中3 個核心活性化合物與PTGS2、PTGS1、ESR1 結合后均展現(xiàn)出了良好的親和力。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學、分子對接等手段，從直觀的角度對痛瀉要方治療CRC 進行了整體的認識，為進一步深入研痛瀉藥方干預CRC 提供了重要參考，相比于傳統(tǒng)藥理學研究呈現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢。受限于本研究僅單純的考慮到中藥、活性化合物、靶點三者之間的數(shù)量關系，尚未兼顧到活性化合物與靶點產生的藥效強度因素，因此藥物在體內的作用機制還需要通過進一步實驗驗證。