彭培軒，張一迪，孫曉琳，周延民

（1.吉林大學口腔醫(yī)院種植科，吉林長春 130021；2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林長春 130021）

骨缺損一直是臨床治療的難題，引導骨組織再生術(shù)（guided bone regeneration，GBR）是治療骨缺損的重要術(shù)式。然而，對很多患者而言，由于侵入性的手術(shù)方式、功能損傷和移植物不太滿意，GBR并不是理想的選擇。此外，持續(xù)的慢性炎癥是GBR后骨組織再生的主要障礙。因此，亟待開發(fā)具有炎癥調(diào)節(jié)作用的骨替代品［1］。

具有免疫調(diào)節(jié)特性的生物材料對組織工程的快速發(fā)展起著重要的作用。在各種免疫細胞中，巨噬細胞在免疫防御過程中的作用至關(guān)重要，其極化狀態(tài)與傷口愈合過程密切相關(guān)。巨噬細胞具有可塑性和多樣性，它有兩種不同的亞型：M1 型（“經(jīng)典激活”）巨噬細胞可引起急性炎癥和組織損傷。 M2型（“交替激活”）巨噬細胞可消除炎癥并參與組織重塑［2，3］。據(jù)報道［4］，白細胞介素4（interleukin 4 ，IL-4）介導的免疫調(diào)節(jié)可以通過M1 和M2 巨噬細胞的轉(zhuǎn)化，顯著增強支架介導的成骨和血管生成。

介孔二氧化硅納米顆粒（mesoporous silica nanoparticles，MSN）自20 世紀問世以來［5］，受到越來越多的關(guān)注。在用于載藥的各種納米顆粒中，MSN 具有獨特的介孔結(jié)構(gòu)、較大的表面積、良好的生物相容性、優(yōu)異的化學穩(wěn)定性和強大的靶向/控釋能力［6］。高表面硅烷醇基團與其他官能團（如胺，羧酸鹽，硫醇和芳環(huán)等）共價共軛［5，7］。 據(jù)報道［8］，它精確的框架結(jié)構(gòu)和良好的孔性可以改善所負載蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

有文獻報道，IL-4 負載的XL-MSN 在體內(nèi)介導M2 巨噬細胞的極化［1］。IL-4 中的氨基可以與MSN上的硅烷醇基形成共價共軛，從而改善IL-4 的時空釋放和局部效應。MCM-41 是一種孔徑較小、合成方法簡便的MSN。但是，IL-4 負載的MCM-41 對巨噬細胞的體外調(diào)節(jié)作用尚不清楚。 因此，本研究合成并表征了MCM-41 型介孔二氧化硅，并對其負載了IL-4，研究了IL-4 負載的MCM-41 對巨噬細胞的影響。此外，本研究還評估了MCM-41/RAW 264.7 和MCM-41-IL-4/RAW 264.7 條件培養(yǎng)基對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的成血管作用。

1 材料與方法

1.1 材料

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、硅酸四乙酯（TEOS）、均三甲苯（Sigma，美國），氫氧化鈉、鹽酸（阿拉丁，中國），無水乙醇（北京化工廠），IL-4（Peprotech，美國），DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone，美國），RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibico，美國），胎牛血清（Gibico，美國），CCK-8 試劑盒（新賽美生物，中國），Calcein-AM/PI 雙染試劑盒（同人化學，日本），F(xiàn)ITC 鬼筆環(huán)肽（翊圣生物，中國），DAPI（索萊寶，中國），RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green qPCR Super Mixture 試劑盒（Takara，日本），多功能酶標儀（Thermo，美國），ABI 7300（ABI，美國）。

1.2 MCM-41 的制備

將1.0 g 的CTAB 和3.5 mL 的2.0 mol/L NaOH 溶解在480 mL 的水中，并在80 ℃下劇烈攪拌2 h，然后向溶液中加入7.0 mL 均三甲苯。 隨后向溶液中滴加5.0 mL TEOS，在80 ℃下劇烈攪拌2 h。離心后得到沉淀物，用乙醇洗滌后在60 ℃下干燥。為除去CTAB 和均三甲苯，將1.0 g 制備的材料加入200 mL 乙酸乙醇溶液中，并在50 ℃下攪拌48 h。每個步驟在相同的受控條件下重復多次。

1.3 MCM-41-IL-4 的制備

將5 μg IL-4 溶 于400 μL 去 離 子 水 中，然 后 將10 mg MSNs 在冰上超聲分散于溶液中。將溶液離心得到的沉淀用去離子水洗滌幾次，冷凍干燥。

1.4 MCM-41 和MCM-41--IL-4 的 表 征

使用在200 kV 加速電壓下運行的JEM-2200FS 透射電子顯微鏡（TEM）獲取樣品的TEM圖像。使用S-4800 掃描電子顯微鏡（SEM）獲得樣品的SEM 圖像。通過EDAX Genesis 2000X 射線能譜儀進行元素分析。使用RINT2000X 射線衍射儀對樣品進行結(jié)構(gòu)分析。氮氣吸附-脫附曲線由Micromeritics ASAP 2020 Plus 比表面積/孔隙分析儀記錄。使用Brunauer-Emmett-Teller（BET）算法和Barrett-Joyner-Halenda（BJH）模型在相對壓力（P/P0）范圍為0.05-0.30 的范圍內(nèi)計算材料的比表面積，孔體積和孔徑。

1.5 細胞培養(yǎng)

鼠源巨噬細胞系RAW 264.7 細胞購自中國上海的賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。RAW 264.7細胞在含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HUVECs 是從吉林省牙齒發(fā)育與骨重塑重點實驗室獲得。HUVEC 在含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。兩種細胞在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%時進行傳代。

1.6 細胞活性檢測

將RAW 264.7 細胞接種到96 孔板中，孵育24 h后將培養(yǎng)液替換為濃度為25、50、100、200、400 μg/mL的MCM-41 和MCM-41-IL-4。孵育2 d 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在37 ℃下孵育2 h，用酶標儀在450 nm 處測量吸光度。用不含納米顆粒的培養(yǎng)基作為對照。為了進一步評估用MCM-41 和MCM-41-IL-4 培養(yǎng)基培養(yǎng)的RAW 264.7 細胞的活力，將RAW 264.7細胞接種到24孔板中，并在37 ℃下孵育24 h 后將培養(yǎng)液替換為濃度為200 μg/mL 的MCM-41 和MCM-41-IL-4 培養(yǎng)1 d，用Calcein-AM/PI 雙染試劑盒檢測活細胞和死細胞。

1.7 細胞形態(tài)檢測

將RAW 264.7 接種在24 孔板中，在濃度為200 μ g/mL 的MCM-41 和MCM-41-IL-4 中 培 養(yǎng)24 h。細胞用4%多聚甲醛固定30 min，并用PBS洗滌3 次。用FITC-鬼筆環(huán)肽對固定細胞的肌動蛋白染色30 min，加入DAPI 對細胞核進行染色15 min，在熒光顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)。

1.8 基因表達分析

將RAW 264.7 細胞接種在6 孔板中，在200 μ g/mL MCM-41 和 MCM-41-IL-4 中 培 養(yǎng)24 h。用RNAiso Plus 提取總RNA，根據(jù)試劑盒說明 逆 轉(zhuǎn) 錄 成 cDNA。 將 2 μ L cDNA、8 μ L ddH2O、1 μ L 前引物F、1 μL 后引物R、12.5 μL TB Green、0.5 μL ROX 混合后，以95 ℃×30 s；95 ℃×5 s→60 ℃×34 s（40 個循環(huán)）；95 ℃×15 s→60 ℃×60 s→95 ℃×15 s 進 行 擴 增，運 用2-ΔΔCt法 計 算 基 因表達量。將RAW 264.7 細胞在200 μg/mL MCM-41 和MCM-41-IL-4 培養(yǎng)2 d 后，收集上清液，并與含有10% FBS 的RPMI 1640 培 養(yǎng) 液1∶1 混 合 作 為 條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)HUVECs 3 d。檢測MMP9 和VEGF 途徑相關(guān)因子PDGFRα和血小板衍生生長因子受體-β（PDGFRβ）基因的mRNA 水平。

1.9 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學軟件Graphpad prism 9.0進行分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MCM-41 和MCM-41-IL-4 的表征

TEM 圖像清楚地顯示MCM-41 的介孔通道和典型六邊形孔隙（圖1A），并且粒徑分布均勻（圖1B）。負載IL-4 后，介孔通道被填充并變的無序（圖1C、1D）。 MCM-41 和MCM-41-IL-4 的粒徑分布如圖2 所示。 MCM-41 和MCM-41-IL-4 的平均直徑 分 別 為（99.822±26.923） nm 和（109.587±24.942）nm。SEM 圖像顯示MCM-41 呈球形或橢圓形，見圖3。 MCM-41-IL-4 比MCM-41 的表面更粗糙（圖3A、3B）并且具有一定的黏性（圖3C、3D）。MSN 的SAXRD 圖譜顯示出一個強峰和兩個弱峰，進一步證明合成的MSN 具有六方介孔結(jié)構(gòu)，見圖4A。MCM-41 的等溫曲線為典型Ⅳ型吸附脫附曲線（圖4B），提示樣品具有中孔結(jié)構(gòu)。 通過B E T 算法和B JH 模型，計算M C M-41 的比表面積、孔容積和孔徑分別為1 037.949 7 m2/g，1.626 754 m2/g，6.269 1 nm，證明樣品具有良好的載藥能力。EDX 元素分析顯示出Si，O 和C 元素的特征峰，見圖4C。經(jīng)計算，Si 占該材料重量的55.14%，O 占該材料重量的44.86%，證明了合成的介孔二氧化硅納米粒子具有較好的純度。

圖1 MCM-41 和MCM-41-IL-4 的透射電鏡圖（A、C：105×；B、D：25 000×）Fig 1 TEM images of MCM-41 and MCM-41-IL-4（A，C：105×；B，D：25 000×）

圖2 MCM-41 和MCM-41-IL-4 的粒徑分布圖Fig 2 Size distribution of MCM-41 and MCM-41-IL-4

圖3 MCM-41 和MCM-41-IL-4 的掃描電鏡圖（A、B：4 000×；C、D：1 000×）Fig 3 SEM images of MCM-41 and MCM-41-IL-4（A，B：4 000×；C，D：1 000×）

圖4 MCM-41 的表征Fig 4 Characterization of MCM-41. A：EDX analysis；B：XRD analysis C：the nitrogen adsorption and desorption curve（inset is pore size distribution）of MCM-41

2.2 RAW 264.7 細胞細胞活性檢測

通過CCK-8 對細胞活性進行檢測，在不同濃度的MCM-41 和MCM-41-IL-4 中 培 養(yǎng)RAW 264.7 細胞48 h 后，細胞活性分析見表1，各組細胞存活率均大于80%，表明MCM-41 和MCM-41-IL-4 沒有細胞毒性。其中12.5、25、50、400 μg/mL MCM-41-IL-4 組的細胞存活率顯著高于空白對照組，說明MCM-41-IL-4 具備促進RAW 264.7 細胞增殖的能力。通過對RAW 264.7 細胞進行死活染色，Calcein-AM 染 色 后 顯 示F-actin 纖 維 紅 色 熒 光，DAPI 染色后顯示細胞核為藍色熒光，免疫熒光照片如圖5，MCM-41 組、MCM-41-IL-4 組和對照組活細胞均占有很大比例，僅有極少量死細胞，證明所合材料有較好的生物安全性。

表1 RAW 264.7 的細胞活性水平（n=3，±s）Tab 1 Cell vitality of RAW 264.7 cells（n=3，±s）

表1 RAW 264.7 的細胞活性水平（n=3，±s）Tab 1 Cell vitality of RAW 264.7 cells（n=3，±s）

組別0 μg/mL MCM-41細胞存活率（%）100.00±13.23組別0 μg/mL MCM-41-IL-4 12.5 μg/mL MCM-41 102.50±9.20 12.5 μg/mL MCM-41-IL-4細胞存活率（%）100.00±14.93 128.67±13.05*25 μg/mL MCM-41 94.00±7.81 25 μg/mL MCM-41-IL-4 142.00±4.24**50 μg/mL MCM-41 85.00±21.07 50 μg/mL MCM-41-IL-4 130.50±13.44*100 μg/mL MCM-41 93.00±18.52 100 μg/mL MCM-41-IL-4 101.50±12.02 200 μg/mL MCM-41 111.00±2.83 200 μg/mL MCM-41-IL-4 95.00±7.07 400 μg/mL MCM-41 106.33±13.87 400 μg/mL MCM-41-IL-4 132.50±6.36*FP 0.98 5.902 0.482 6 F P 0.009 5

圖5 RAW 264.7 細胞的死活染色圖片（12×）Fig 5 Representative images of live-dead cell staining of RAW 264.7 cells（12×）

2.3 RAW 264.7 細胞細胞形態(tài)檢測

FITC 標記的鬼筆環(huán)肽染色后顯示細胞纖維狀肌動蛋白（F-actin）為綠色熒光，DAPI 染色后顯示細胞核為藍色熒光，肌動蛋白絲發(fā)生解聚或重排，F(xiàn)-actin 的熒光強度會發(fā)生改變。免疫熒光照片如 圖6 所 示，MCM-41-IL-4 組 的RAW 264.7 細胞相比于MCM-41 組和對照組F-actin 熒光強度增 強；200 μg/mL MSNs-IL-4 處 理 的RAW 264.7細胞相比與100 μg/mL MSNs-IL-4F-actin 熒光強度增強，提示MCM-41-IL-4 可以促進細胞骨架微絲結(jié)構(gòu)重排、聚合發(fā)生改建。見圖6。

圖6 RAW264.7 細胞的FITC-鬼筆環(huán)肽-DAPI 染色的照片（70×）Fig 6 Representative fluorescence image of FITC-Phalloidin-DAPI staining of RAW 264.7 cells（70×）

2.4 RAW 264.7 細胞基因表達分析

qRT-PCR 結(jié)果表明，與對照組相比，MCM-41-IL-4 處理組的TGF-β、Arg-1，血管內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A），堿性磷酸酶（ALP）mRNA 表達水平升高；與MCM-41 處理組相比，MCM-41-IL-4 處理組的IL-1ra、Arg-1、ALPmRNA 表達水平升高，IL-6的mRNA 表達水平降低；白細胞介素10（IL-10）表達水平在各組間無明顯差異。 因此，MCM-41-IL-4可以升高RAW 264.7 細胞M2 型相關(guān)基因TGF-β、IL-1ra、Arg-1的 表 達，降 低M1 型 相 關(guān) 基 因IL-6的表達，見表2。

表2 MCM-41 和MCM-41-IL-4 刺激RAW 264.7 細胞1 d 后炎癥因子的mRNA 水平（n=3，±s）Tab 2 The relative mRNA levels of inflammatory factors of RAW 264.7 cells after treated by MCM-41 and MCM-41-IL-4 for 1 d（n=3，±s）

表2 MCM-41 和MCM-41-IL-4 刺激RAW 264.7 細胞1 d 后炎癥因子的mRNA 水平（n=3，±s）Tab 2 The relative mRNA levels of inflammatory factors of RAW 264.7 cells after treated by MCM-41 and MCM-41-IL-4 for 1 d（n=3，±s）

注：與Control 組比較，*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001；與MCM-41 組比較,##P＜0.01,###P＜0.001。

mRNA Control 200 μg/mL MCM-41 200 μg/mL MCM-41-IL-4 F P TGF-β 1.08±0.48 3.76±1.45*5.15±0.91**12.180 0.007 7 IL-1ra 1.00±0.14 0.65±0.01*1.04±0.16##9.530 0.013 7 Arg-1 IL-10 IL-6 VEGF-A ALP 1.00±0.11 1.02±0.25 1.00±0.05 1.00±0.02 1.00±0.08 0.88±0.16 0.77±0.20 1.62±0.09***3.58±0.32***0.72±0.10**2.70±0.70***###＜0.000 1 0.247 4＜0.000 1 0.000 6＜0.000 1 1.21±0.38 0.96±0.09###2.54±0.60**3.08±0.10***###44.720 1.779 154.500 32.750 582.700

2.5 HUVECs 的基因表達分析

為研究MCM-41 和MCM-41-IL-4 通過免疫調(diào)節(jié)的血管生成作用，檢測了HUVECs 中血管生成因子和VEGF 通路相關(guān)因子的表達。MCM-41/RAW 264.7 條件培養(yǎng)基刺激可提高HUVECs 血管生成相關(guān)因子MMP9 和VEGF 通路相關(guān)因子PDGFRα 的表達水平。MCM-41-IL-4/RAW 264.7條件培養(yǎng)基刺激也可提高HUVECs 的MMP9 表達水平，見表3。

表3 MCM-41/RAW 264.7 和MCM-41-IL-4/RAW 264.7 條件培養(yǎng)基處理2 d 后HUVECs 的血管生成相關(guān)因子和VEGF 通路相關(guān)因子的mRNA 表達水平（n=3，±s）Tab 3 Angiogenetic factor and VEGF pathway-related factors mRNA level of HUVECs treated with MCM-41/RAW 264.7-conditioned medium and MCM-4-IL-41/RAW 264.7-conditioned medium for 2 d（n=3，±s）

表3 MCM-41/RAW 264.7 和MCM-41-IL-4/RAW 264.7 條件培養(yǎng)基處理2 d 后HUVECs 的血管生成相關(guān)因子和VEGF 通路相關(guān)因子的mRNA 表達水平（n=3，±s）Tab 3 Angiogenetic factor and VEGF pathway-related factors mRNA level of HUVECs treated with MCM-41/RAW 264.7-conditioned medium and MCM-4-IL-41/RAW 264.7-conditioned medium for 2 d（n=3，±s）

注：與Control 組比較，*P＜0.05,***P＜0.001；與MCM-41/RAW 264.7 組比較,###P＜0.001。

組別Control MCM－41/RAW 264.7 MCM－41－IL－4/RAW 264.7 F P MMP9 1.01±0.18 4.28±0.54***1.34±0.57###44.93 PDGFRα 1.00±0.10 1.89±0.44*1.44±0.32 5.893 PDGFRβ 1.06±0.40 0.77±0.40 1.93±0.91 2.902 0.000 2 0.038 4 0.131 4

3 討論

炎癥在骨損傷修復和再生中具有重要的作用［4，9］，且宿主對于骨替代材料的免疫反應受到越來越多關(guān)注［10，11］。這些研究主要集中在探索影響巨噬細胞的材料的表面修飾，如表面形貌、孔隙率和離子釋放［11-16］。然而受到復雜的生物環(huán)境的影響，材料特性不能準確地調(diào)節(jié)材料-宿主反應。IL-4 是經(jīng)典的誘導M2 型巨噬細胞極化的細胞因子。 據(jù)報道［4］，適量的IL-4 可以產(chǎn)生最理想的M1/M2 巨噬細胞轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生有利于組織愈合的微環(huán)境。

孔徑和孔體積對于MSN 的藥物釋放速率和載藥量起重要作用［5］。據(jù)報道［17］，介孔二氧化硅納米顆粒擴大的孔徑提高了藥物遞送的速率。由于其較高的包封率，更大孔徑的介孔納米材料每單位表面積具有更高的載藥量和釋放速率。通過CTAB模板法，制備典型的MSN 孔徑小于3 nm，適用于小分子藥物的應用，但無法負載大分子（例如DNA，RNA 和蛋白質(zhì)）［5］。因此，本研究采用了改進的方法［8］，通過向CTAB 模板中添加大量擴孔劑（均三甲苯）來制備具有較大的孔徑（6 nm）和體積（1.63 cm3/g）的MSN，即可以負載高分子量蛋白質(zhì)的MCM-41 型MSNs。

本研究結(jié)果表明，MCM-41-IL-4 可以刺激RAW 264.7 細胞的增殖，促進細胞骨架微絲結(jié)構(gòu)重排、聚合發(fā)生改建；MCM-41-IL-4 可以升高RAW 264.7 細胞M2 型相 關(guān)基因TGF-β、IL-1ra、Arg-1的表達，降低M1 型相關(guān)基因IL-6的表達；MCM-41-IL-4/RAW 264.7 條件培養(yǎng)可以促進HUVECs的血管生成相關(guān)因子MMP9的表達。因此，MCM-41-IL-4 可以促進RAW 264.7 巨噬細胞的增殖，細胞骨架改建，以及M2 型極化，從而產(chǎn)生有利于組織再生的免疫微環(huán)境。

作者貢獻度說明：

彭培軒：實驗設計，實驗完成，數(shù)據(jù)處理，論文寫作；張一迪：死活細胞染色、免疫熒光實驗指導，論文修改；孫曉琳：論文修改；周延民：論文修改。