吳昊霖，蔡來燕，樊好飛，方星悅，徐怡倩，虞道銳，唐曉亮，劉啟兵，2

（1. 海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院藥理學(xué)教研室，海南 ?？?571199；2. 海南省熱帶腦科學(xué)研究與轉(zhuǎn)化重點實驗室，海南 海口 571199）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于周圍組織中沉積尿酸鈉（monosodium urate，MSU）晶體引起的一種自身炎癥反應(yīng)，最常見于關(guān)節(jié)內(nèi)和關(guān)節(jié)周圍［1］。據(jù)報道，痛風(fēng)還與其他疾病相關(guān)，包括心血管疾病、慢性腎病、肥胖和2 型糖尿病等相關(guān)。此外，最近的研究表明痛風(fēng)是心血管疾病的獨立危險因素之一。別嘌呤醇、非布索坦、秋水仙堿和苯溴馬隆等合成類藥物可減輕尿酸沉積造成的炎癥和疼痛，而被廣泛應(yīng)用。然而，這些降低尿酸鹽的化合藥物都有一定急慢性不良反應(yīng)，如惡心、皮疹、過敏、肝轉(zhuǎn)氨酶升高和肝毒性等［2，3］。因此，迫切需要開發(fā)安全系數(shù)高的痛風(fēng)治療藥物。此前，多項研究顯示，天然產(chǎn)物對痛風(fēng)具有良好的治療效果，有報道顯示植物提取物及其分離的成分在體外和體內(nèi)均有抗痛風(fēng)活性和抗炎作用［4］。其中，中醫(yī)特有藥材杜仲（Eucommmia ulmoidesOliver）、大血藤（Sargentodoxa cuneataOliv.Rehd.et Wils.）、雞 血 藤（Spatholobi caulis）和 桑 黃（Phellinus igniarius）的抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗炎的研究多有報道，同時也有研究表明這四種中藥抗炎作用與IL-1β 有關(guān)［5-9］。然而目前對這四種中藥的研究多集中在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的研究略有欠缺。本文采取水提法提取四種藥材，并利用MSU 制造小鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，旨在探究杜仲、大血藤、雞血藤和桑黃四種中藥提取物的抗痛風(fēng)效果，為臨床治療痛風(fēng)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級雌性昆明種小鼠，重量（25±5）g，由海南醫(yī)學(xué)院藥物安全評價中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：HNXK（瓊）2019-0018。

1.2 藥物與試劑

杜仲、大血藤、雞血藤、桑黃中藥提取物自制；秋水仙堿片，Macklin 公司（批號C10855147）；尿酸鈉，Sigma 公司（批號BCBS7438）；大、小鼠IL-1β ELISA 檢測試劑盒，Servicebio（批號GM1153）。

1.3 儀器

RB-200 智能熱板儀（成都泰盟軟件有限公司）；AL204 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；邁瑞獸用全自動血液細(xì)胞分析儀（BC-2800vet）。

1.4 中藥提取物制備

杜仲、大血藤、雞血藤和桑黃各精確稱量1 kg干品，加2 L 蒸餾水回流提取2 次，每次1 h。合并提取液，真空減壓濃縮至0.2 L。

1.5 實驗分組與給藥

小鼠正常喂飼2 周，取70 只小鼠隨機(jī)分為7 組，每組10 只，分別為正常組、模型組、秋水仙堿組、雞血藤組、大血藤組、桑黃組、杜仲組，置于溫度為（55.0±5）℃熱板上進(jìn)行痛敏篩選，舔后足時間小于5 s 、大于30 s 或跳躍頻繁的小鼠不予采用，最終各組取6 只合格小鼠進(jìn)行實驗。將濃縮后的雞血藤水溶液、大血藤水溶液、桑黃水溶液、杜仲水溶液，灌胃給藥（2×10-4L/只），正常組給予生理鹽水灌胃（2×10-4L/只），秋水仙堿組、雞血藤組、大血藤組、桑黃組和杜仲組均配置0.4 mL/mg 水溶液（0.2 mL/只）灌胃給藥10 天，并于末次給藥1 h 后造模。造模后停止藥物干預(yù)。

1.6 造模

將MSU 用無菌生理鹽水配成50 g/L 的MSU混懸液。水合氯醛麻醉小鼠，將右側(cè)踝關(guān)節(jié)稍微彎曲，手可明顯觸摸到兩骨突起并用4.5 號注射針在突起間隙之間進(jìn)針，此時有漏空感，即證明注射到關(guān)節(jié)腔內(nèi)。正常組小鼠右踝關(guān)節(jié)每只注射1×10-4L生理鹽水，模型組、秋水仙堿組、雞血藤組、大血藤組、桑黃組、杜仲組每只小鼠注射1×10-4LMSU 混懸液。建模后每組小鼠的右后踝關(guān)節(jié)腫脹，則初步定義為建模成功。

1.7 足跖腫脹觀察

分別于致炎前后測定右后足跖直徑。觀察和測定注射后24 h 小鼠右后足跖腫脹情況、體重和痛閾值，計算小鼠關(guān)節(jié)直徑比。

1.8 痛閾值觀察

42 只小鼠造模成功后，于24 h 和36 h 測定各組小鼠痛閾值，以小鼠舔后足時間作為觀察指標(biāo)，1 min 內(nèi)舔后足的小鼠按實際舔足時間計入痛閾值，1 min 未有舔后足反應(yīng)者，以1 min 計入痛閾值［10］。

1.9 小鼠血液分析

1.9.1 全血樣本 小鼠眼球取血，取適量抗凝全血樣本裝入EDTA 抗凝管，EDTA 與全血充分混勻。1.9.2 血清樣本 全血于室溫放置2 h 后于2～8 ℃，3 000 r/min 離心15 min，取上清液立即檢測。IL-1β 檢測參照ELISA 試劑盒說明書。

1.9.3 血漿樣本 全血采集后30 min 內(nèi)于2～8 ℃3 000 r/min 離心15 min，取上清液立即檢測。用邁瑞獸用全自動血液細(xì)胞分析儀分析血液報告。

1.10 小鼠踝關(guān)節(jié)病理分析

取踝關(guān)節(jié)周圍的關(guān)節(jié)組織，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋制備成5 μm 組織切片，經(jīng)脫蠟復(fù)水、抗原修復(fù)、免疫反應(yīng)后加入蘇木素伊紅染液染色，脫水封片，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)形態(tài)變化。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，計量數(shù)據(jù)用（±SEM）表示，兩組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組小鼠左右足趾對比

由圖1 可見，正常組左右足對比未見明顯形態(tài)學(xué)改變。模型組和中藥提取物各組小鼠右足趾均可見不同程度的腫脹，和模型組比較，雞血藤組形態(tài)學(xué)變化最輕，杜仲和大血藤組次之，桑黃組腫脹較為明顯。

圖1 各組小鼠左右足形態(tài)對比Fig 1 Changes comparision between the left and right toes of the experimental mice

2.2 四種中藥提取物對小鼠體重的影響

由圖2 可見，預(yù)防給藥前各組小鼠（F＝1.699，P＞0.05）與預(yù)防給藥10 d 后（F＝2.137，P＞0.05）體重?zé)o明顯差異。

圖2 四種中藥提取物對MSU 引起痛風(fēng)小鼠模型體重的影響Fig 2 The effect of four herb extracts on the body weight of mice models of gout induced by MSU

2.3 四種中藥提取物對MSU 致小鼠關(guān)節(jié)直徑的影響

由圖3 可見，與正常組比較，模型組小鼠24 h 關(guān)節(jié)直徑比（t＝5.086，P＜0.01）顯著升高。與模型組比較，秋水仙堿組（t＝11.18，P＜0.05）、杜仲組（t＝4.969，P＜0.05）、大血藤組（t＝3.379，P＜0.05）和雞血藤組（t＝4.489，P＜0.05）在24 h 小鼠關(guān)節(jié)直徑比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。雞血藤組在24 h 降低關(guān)節(jié)直徑最為明顯，杜仲組次之。桑黃組（t＝0.986 6，P＞0.05）保護(hù)效果較弱，和模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 四種中藥提取物對MSU 所致小鼠關(guān)節(jié)直徑的影響Fig 3 The effect of four herb extracts on the joint diameter of mice models of gout induced by MSU

2.4 四種中藥提取物對小鼠鎮(zhèn)痛作用的影響

圖4、5 可見，與正常組比較，24 h（t＝3.967，P＜0.05）和36 h（t＝2.937，P＜0.05）模型組的痛閾值分別為27.2 s 和32.75 s，痛閾值明顯下降。與模型組比較，24 h 杜仲組（t＝2.893，P＜0.05）和大血藤組（t＝2.605，P＜0.05）痛閾值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；雞血藤組（t＝1.255，P＞0.05）與模型組比較，痛閾值有一定的升高，但由于組內(nèi)差異較大，無統(tǒng)計學(xué)意義。36 h 時杜仲組（t＝4.952，P＜0.05）和雞血藤組（t＝2.835，P＜0.05）的痛閾值明顯升高，和模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中杜仲組鎮(zhèn)痛效果甚至優(yōu)于秋水仙堿組。

圖4 四種中藥提取物24 h 對MSU 所致小鼠痛閾值的影響Fig 4 The effect of four herb extracts on the 24 h pain tolerance of mice models of gout induced by MSU

圖5 四種中藥提取物36 h 對MSU 所致小鼠痛域的影響（n＝6，±SEM）Fig 5 The effect of four herb extracts on 36 h pain tolerance of mice models of gout induced by MSU

2.5 四種中藥提取物對小鼠血液中白細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和IL-1β 表達(dá)水平的影響

和模型組比較，杜仲組（t＝4.681；t＝2.31；t＝3.252）和雞血藤組（t＝4.895；t＝2.466；t＝3.752）能明顯減小血液中的白細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量（P均＜0.05），見表1。雞血藤組對三種細(xì)胞的影響較為明顯。杜仲組（t＝2.9）、大血藤組（t＝4.0）和桑黃組（t＝3.4）的IL-1β 水平均顯著降低，和模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但雞血藤未能明顯抑制IL-1β 的表達(dá)水平。

表1 四種中藥提取物對小鼠血液中白細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和IL-1β 表達(dá)水平的影響（n＝6，±SEM）Tab 1 The effects of four herb extracts on the expression levels of leukocytes，monocytes，neutrophils and IL-1β expression in the blood of mice（n＝6，±SEM）

表1 四種中藥提取物對小鼠血液中白細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和IL-1β 表達(dá)水平的影響（n＝6，±SEM）Tab 1 The effects of four herb extracts on the expression levels of leukocytes，monocytes，neutrophils and IL-1β expression in the blood of mice（n＝6，±SEM）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

劑量組別單核細(xì)胞（109/L）正常組模型組秋水仙堿組杜仲組大血藤組雞血藤組桑黃組IL-1β（pg/mL)12.61±6.25 89.71±44.35**24.39±11.44#37.84±11.05#27.15±0.73#95.47±27.34 31.83±8.61#9.412 0.000 3－2.5 mg/只0.1 mg/kg 0.2 mL/只0.2 mL/只0.2 mL/只0.2 mL/只FP白細(xì)胞（109/L）5.34±0.91 13.32±3.34**4.20±0.59#6.00±0.28#5.40±1.29#4.60±1.76#8.30±2.52#13.48＜0.000 1 0.16±0.05 0.58±0.34**0.30±0.17 0.18±0.07#0.44±0.30 0.16±0.05#0.30±0.06 2.86 0.026 2中性粒細(xì)胞（109/L）0.94±0.22 2.86±1.09**1.20±0.63#1.04±0.27#1.56±0.80 0.76±0.27#1.62±0.56 5.145 0.001 1

2.6 對小鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)組織病理變化的影響

由圖6 可見，正常組未觀察到炎癥細(xì)胞浸潤；模型組小鼠出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，秋水仙堿組明顯改善并降低炎性細(xì)胞浸潤；杜仲組、大血藤組、雞血藤組和桑黃組均明顯改善炎性細(xì)胞浸潤和水腫，滑膜層細(xì)胞部分恢復(fù)正常，其中雞血藤組改善效果最明顯。

圖6 四種中藥提取物對小鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)組織病理變化的影響（H &E，×10）Fig 6 The effect of four herb extracts on the pathological changes of the left ankle joint in mice（H &E，×10）

3 討論

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于尿酸鹽晶體沉積于關(guān)節(jié)及其周圍組織而引起的炎癥反應(yīng)性病癥［4］。炎癥是機(jī)體對內(nèi)源或外源性刺激引起組織損傷的一種復(fù)雜病理反應(yīng)，主要通過單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和白細(xì)胞分泌多種與組織炎癥有關(guān)的促炎性細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子（TNF-α）、IL-1β 等，這使得它們成為多種疾病治療干預(yù)的關(guān)鍵靶點［11］。

大多數(shù)傳統(tǒng)的抗痛風(fēng)藥都有副作用，如心血管和胃腸道不良反應(yīng)，因此，探索新的、有效的、安全的抗炎治療方法迫在眉睫［2，3］。中藥提取物具有顯著的抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用。而且大多數(shù)中藥提取物對人和動物都相對安全。近年來，中藥提取物由于其安全性、抗炎鎮(zhèn)痛效果和免疫調(diào)節(jié)特性而受到廣泛關(guān)注［11］。將MSU 混懸液注射于小鼠的踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，形成局部范圍如關(guān)節(jié)滑膜、軟骨等組織短時間內(nèi)MSU 沉積而刺激關(guān)節(jié)產(chǎn)生炎癥是目前較好的痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎造模方式之一［1，12］，本實驗采用上述方法成功制造痛風(fēng)性小鼠模型。Pope 等［13］發(fā)現(xiàn)，MSU 對關(guān)節(jié)液和血液中含有的單核細(xì)胞與吞噬細(xì)胞產(chǎn)生刺激作用，并釋放大量的炎癥因子IL-1β。IL-1β 是痛風(fēng)炎癥的核心蛋白，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生［2］，其通過刺激促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子上調(diào)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞）的募集，降解軟骨基質(zhì)，從而導(dǎo)致軟骨吸收和骨破壞，同時引發(fā)劇烈疼痛、水腫 等 癥 狀，進(jìn) 而 加 劇 痛 風(fēng) 相 關(guān) 炎 癥［14，15］。同 時，MSU 在痛風(fēng)發(fā)作期間誘導(dǎo)溶酶體和細(xì)胞膜溶解、白細(xì)胞的額外募集和炎癥介質(zhì)的進(jìn)一步釋放，導(dǎo)致持續(xù)性炎癥［2］。Gao 等［16］研究發(fā)現(xiàn)杜仲提取物具有促進(jìn)膠原合成和保護(hù)軟骨的作用，Guo 等［11］研究發(fā)現(xiàn)大血藤多糖有較好的抗炎療效，Cheng 等［17］通過體外實驗發(fā)現(xiàn)雞血藤水提取物可以靶向NF-κB 發(fā)揮抗炎作用和減輕氧化應(yīng)激。Ku 等［18］表明桑黃多糖可以改善脂多糖誘導(dǎo)的炎癥。本實驗通過ELISA試驗和全血分析重點監(jiān)測了IL-1β 的表達(dá)水平以及單核細(xì)胞、白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量，驗證了杜仲、大血藤和桑黃通過抑制IL-1β 發(fā)揮抗炎作用并且杜仲抑制IL-1β 的效果明顯。應(yīng)用痛風(fēng)經(jīng)典檢測手段關(guān)節(jié)直徑比和痛閾值驗證四種中藥提取物的鎮(zhèn)痛消腫作用，發(fā)現(xiàn)雞血藤雖然具有較好的鎮(zhèn)痛和消腫效果，并且通過病理組織切片進(jìn)一步證實其在改善炎細(xì)胞浸潤、水腫和滑膜層細(xì)胞上的治療效果，但未能抑制IL-1β 的表達(dá)水平，說明雞血藤有著良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用和治療痛風(fēng)的潛力，但可能并不作用于IL-1β。從關(guān)節(jié)直徑比、痛域值對比發(fā)現(xiàn)，大血藤療效明顯，其持續(xù)效果很好，桑黃雖然也有部分抗炎鎮(zhèn)痛作用，也有研究報道了其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎上的治療潛力［8］，但本次實驗發(fā)現(xiàn)其對于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的療效不佳。

本實驗提取的杜仲、大血藤、雞血藤和桑黃制劑所含成分較多且復(fù)雜，因此仍需進(jìn)一步分離純化驗證是哪一類活性物質(zhì)對抗痛風(fēng)作用療效更好，以及探討何種濃度中藥提取物能發(fā)揮最大療效。

作者貢獻(xiàn)度說明：

吳昊霖：參與實驗，撰寫論文；蔡來燕：參與實驗，整理數(shù)據(jù)；樊好飛：指導(dǎo)實驗，參與實驗；方星悅：參與實驗，購買耗材；徐怡倩：參與實驗，整理數(shù)據(jù)；虞道銳：參與實驗，提供實驗器材；唐曉亮：確定實驗所需中藥，提取中藥有效成分；劉啟兵：指導(dǎo)實驗，參與實驗，修改論文。