郭艷娟 趙楠楠 周劍利 董建新 袁金靈 高 杰

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北唐山 063000

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）位居女性全身惡性腫瘤第四位[1]。近年來，全球EC 發(fā)病率和病死率逐年升高，且有年輕化趨勢(shì)[2]。Ⅱ型EC 是一種非雌激素依賴性上皮樣癌，占EC 的10%～20%，因其具有高度侵襲性，預(yù)后極差[3]，故探究預(yù)示Ⅱ型EC 預(yù)后的生物標(biāo)志物具有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一種由200 個(gè)及以上核苷酸組成的RNA，不具備編碼蛋白質(zhì)功能[4]。目前，已有多數(shù)lncRNA 被報(bào)道參與EC 發(fā)病和進(jìn)展過程，如lncRNA miR143HG[5]、lncRNA NEAT1[6]和lncRNA DCST1-AS1[7]等。lncRNA TUBA4B是lncRNA 家族成員之一，已被報(bào)道可靶向miR-26b/PTEN 通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并促進(jìn)其凋亡[8]。miR-26b/PTEN 通路與EC 細(xì)胞的侵襲和遷移關(guān)系密切[9]，有理由認(rèn)為lncRNA TUBA4B 與EC 有關(guān)，其水平或可反映EC 患者的預(yù)后。本研究分析lncRNA TUBA4B 與Ⅱ型EC 預(yù)后的關(guān)系，以期為評(píng)估Ⅱ型EC患者的預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013 年3 月至2017 年7 月在華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診的123 例Ⅱ型EC患者作為研究對(duì)象。參照《子宮內(nèi)膜癌診斷與治療指南（第四版）》[10]診治Ⅱ型EC。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)病理確診為Ⅱ型EC；②配合完成本研究所需相關(guān)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①復(fù)發(fā)的EC；②病理檢查前接受化療、放療等。123 例Ⅱ型EC 患者年齡34～69 歲，平均（54.76±7.04）歲；漿液性乳頭狀腺癌75 例，透明細(xì)胞癌40 例，惡性米勒管混合瘤3 例，未分化癌5 例；低分化47 例，中分化45 例，高分化31 例；浸潤深度≤1/2 肌層48例，＞1/2 肌層75 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24 例；子宮外轉(zhuǎn)移24 例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期（International Federation of Gynecology and Obste-trics staging，F(xiàn)IGO 分期）Ⅰ期70 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期19 例，Ⅳ期11 例；手術(shù)治療41 例，手術(shù)治療+化療20 例，手術(shù)治療+放療36 例，手術(shù)治療+化療+放療26 例。本研究所有患者均知情同意，并簽署了知情同意書。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：20200228002）。

1.2 隨訪

用復(fù)診及電話隨訪方式進(jìn)行隨訪，于出院后1 個(gè)月開始隨訪，每3 個(gè)月隨訪1 次，末次隨訪時(shí)間為2020 年8 月17 日，中位隨訪時(shí)間為36 個(gè)月。本研究隨訪終點(diǎn)為隨訪過程中死亡或至末次隨訪結(jié)束，期間無失訪患者。

1.3 lncRNA TUBA4B 水平檢測(cè)

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法[11]檢測(cè)lncRNA TUBA4B水平，步驟如下：①取EC 組織，將其研磨為組織勻漿，用TRIzol 試劑提取總RNA；②用紫外分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器五廠有限公司）檢測(cè)RNA 純度，吸光度值比（OD260/280）在1.9～2.0；③取2 μg 的RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKARA 公司，批號(hào)：6110A1）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；④用PCR 儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]擴(kuò)增cDNA，擴(kuò)增條件為95℃5 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，35 個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct計(jì)算lncRNA TUBA4B 的水平。本研究引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)，lncRNA TUBA4B 序列正向引物：5’-CCCACAGGCTTTAAGGTTGA-3’，反向引物：5’-AGGCCATAGTGATGGCTGTC-3’；內(nèi)參GAPDH 序列正向引物：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，反向引物：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用3.6.3 版R 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者操作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）評(píng)價(jià)lncRNA TUBA4B 對(duì)EC 預(yù)后的診斷價(jià)值。采用Kaplan-Meier 繪制TUBA4B 水平的生存曲線，采用Log-Rank 法進(jìn)行比較。采用Cox 回歸分析EC 預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素。采用限制性立方樣條擬合Cox 回歸分析lncRNA TUBA4B與EC 預(yù)后的關(guān)系。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組lncRNA TUBA4B 水平比較

Ⅱ型EC 患者1、2、3 年總生存率分別為90.24%（111/123）、71.54%（88/123）和66.67%（82/123）。根據(jù)Ⅱ型EC 患者3 年預(yù)后情況將其分為生存組（82 例）和死亡組（41 例）。生存組lncRNA TUBA4B 水平為（0.81±0.09），高于死亡組的（0.69±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.204，P ＜0.001）。

2.2 lncRNA TUBA4B 診斷Ⅱ型EC 預(yù)后的價(jià)值

lncRNA TUBA4B 診斷Ⅱ型EC 預(yù)后的ROC 曲線下面積、最佳截?cái)帱c(diǎn)、約登指數(shù)、敏感度和特異度分別為0.836（95%CI：0.757～0.914）、0.70、0.585、63.41%和95.12%。見圖1。

圖1 lncRNA TUBA4B 診斷Ⅱ型EC 預(yù)后的ROC 曲線

2.3 兩組生存情況分析

根據(jù)lncRNA TUBA4B 診斷Ⅱ型EC 預(yù)后的最佳截?cái)帱c(diǎn)將123 例Ⅱ型EC 患者分為高TUBA4B 組（93 例）和低TUBA4B 組（30 例）。高TUBA4B 組中位生存時(shí)間為36 個(gè)月，高于低TUBA4B 組的13 個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-Rank χ2=104.897，P ＜0.001）。見圖2。

圖2 兩組生存曲線比較

2.4 影響Ⅱ型EC 預(yù)后因素的Cox 回歸分析

將Ⅱ型EC 患者3 年生存預(yù)后作為因變量，將年齡、腫瘤病理類型、分化程度、FIGO 分期、治療方式和lncRNA TUBA4B 作為自變量（變量賦值見表1），納入Cox 單因素分析，結(jié)果顯示分化程度、FIGO 分期、治療方式和lncRNA TUBA4B 均與Ⅱ型EC 預(yù)后有關(guān)（P ＜0.05）。見表2。將分化程度、FIGO 分期、治療方式和lncRNA TUBA4B 作為自變量，納入Cox 多因素分析，結(jié)果顯示FIGO 分期高和治療方式復(fù)雜是Ⅱ型EC 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P ＜0.05），分化程度高和lncRNA TUBA4B 水平高是Ⅱ型EC 預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素（P ＜0.05）。見表2。

表1 變量賦值

表2 影響Ⅱ型EC 預(yù)后因素的Cox 回歸分析

2.5 lncRNA TUBA4B 與Ⅱ型EC 預(yù)后的相關(guān)性分析

用限制性立方樣條擬合Cox 回歸分析lncRNA TUBA4B 與Ⅱ型EC 預(yù)后的關(guān)系，當(dāng)節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)為5 時(shí)，AIC 值最小（AIC=298.723），此時(shí)，結(jié)果顯示lncRNA TUBA4B 與Ⅱ型EC 預(yù)后有關(guān)（χ2=68.83，P ＜0.001），呈非線性關(guān)系（χ2=18.76，P ＜0.001）。以lncRNA TUBA4B 診斷Ⅱ型EC 預(yù)后的最佳截?cái)帱c(diǎn)作為參考點(diǎn)，當(dāng)lncRNA TUBA4B≥0.70 時(shí)，Ⅱ型EC 預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)降低；當(dāng)lncRNA TUBA4B＜0.70 時(shí)，Ⅱ型EC 預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)升高。見圖3。

圖3 lncRNA TUBA4B 與Ⅱ型EC 預(yù)后的劑量-反應(yīng)圖

3 討論

Ⅱ型EC 具有高度侵襲性，治療效果尚不理想，預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)高[12-15]。近年來，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Ⅱ型EC 的無進(jìn)展生存期和總生存期已有一定改善，但總體預(yù)后較Ⅰ型EC 仍不樂觀[16-20]。本研究隨訪了解到123 例Ⅱ型EC 患者1、2 和3 年總生存率分別為90.24%、71.54%和66.67%，該結(jié)果與藍(lán)喜等[3]研究結(jié)果接近。

本研究結(jié)果顯示生存組lncRNA TUBA4B 水平高于死亡組，提示lncRNA TUBA4B 水平與Ⅱ型EC 預(yù)后有關(guān)，其水平或可評(píng)價(jià)預(yù)后。遂構(gòu)建lncRNA TUBA4B診斷Ⅱ型EC 預(yù)后的ROC 曲線，結(jié)果顯示其曲線下面積、敏感度和特異度分別為0.836、63.41%和95.12%，表明lncRNA TUBA4B 對(duì)于Ⅱ型EC 患者預(yù)后評(píng)估有一定價(jià)值，但敏感度低，可輔助用于評(píng)價(jià)Ⅱ型EC預(yù)后。

既往研究[3,21-26]表明EC 分化程度、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、子宮外轉(zhuǎn)移、FIGO 分期和治療方式等均與Ⅱ型EC 預(yù)后密切相關(guān)。為避免混雜因素及各因素間共線性等問題，僅將Ⅱ型EC 患者年齡、腫瘤病理類型、分化程度、FIGO 分期、治療方式和lncRNA TUBA4B納入了Cox 回歸分析，結(jié)果顯示FIGO 分期高和治療方式復(fù)雜是Ⅱ型EC 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，分化程度高是Ⅱ型EC 預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，與上述研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果還顯示，lncRNA TUBA4B 水平高是Ⅱ型EC 預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。限制性立方樣條擬合Cox 回歸結(jié)果顯示當(dāng)lncRNA TUBA4B＞0.70 時(shí)，Ⅱ型EC 預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)降低；當(dāng)lncRNA TUBA4B＜0.70 時(shí)，Ⅱ型EC 預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)升高。推測(cè)其原因是lncRNA TUBA4B 調(diào)節(jié)miR-26b/PTEN 通路參與EC 細(xì)胞的侵襲和遷移，進(jìn)而影響EC 預(yù)后，檢測(cè)其水平可了解EC預(yù)后情況。

本研究尚存在一定不足，一是因Ⅱ型EC 發(fā)病率偏低，致使本研究納入的樣本量偏小，分析結(jié)果可能存在一定偶然性；二是未開展基礎(chǔ)研究分析lncRNA TUBA4B 是否通過調(diào)控miR-26b/PTEN 通路參與EC細(xì)胞的侵襲、遷移等過程。鑒于本研究存在以上不足，為更好地了解lncRNA TUBA4B 與Ⅱ型EC 預(yù)后的關(guān)系，還需開展大樣本、前瞻性研究驗(yàn)證本研究結(jié)果，同時(shí)開展基礎(chǔ)研究分析lncRNA TUBA4B 影響Ⅱ型EC預(yù)后的病理生理機(jī)制。

綜上所述，lncRNA TUBA4B 水平與Ⅱ型EC 預(yù)后有關(guān)，檢測(cè)其水平有助于評(píng)價(jià)患者預(yù)后。LncRNA TUBA4B 水平高提示患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)低。