包艷春，關秀軍，王小娟，胡亞丹

心力衰竭是一種由多種原因?qū)е滦呐K收縮功能和(或)舒張功能障礙的復雜臨床綜合征，我國35～74歲人群患病率約為0.9%[1]。心力衰竭治療已由以往的強心利尿轉(zhuǎn)變?yōu)橐宰钄嘟桓猩窠?jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素系統(tǒng)為主的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)過度激活為主，病人病死率、再次住院率居高不下。有研究認為，遺傳變異是導致藥物反應個體差異的重要原因[2]。心肌細胞線粒體形態(tài)及功能穩(wěn)定對維持正常的心臟結(jié)構(gòu)及功能具有重要的作用，在心肌缺血、衰老及心力衰竭病人中均觀察到不同程度的線粒體損傷。相關研究表明，心力衰竭、心肌病等病理情況下，核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1，NRF-1)在維持線粒體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[3]。NRF-1高表達有助于心肌細胞存活，具有增強細胞呼吸能力和代謝水平，減輕或預防心力衰竭的發(fā)生。上述研究說明NRF-1表達在防治心力衰竭中的重要作用。NRF-1基因多態(tài)性直接影響NRF-1基因及相關蛋白的表達。目前，關于NRF-1基因多態(tài)性與慢性心力衰竭的關系及藥物干預后療效研究較少。本研究旨在探討NRF-1基因+141 G/T多態(tài)性與慢性射血分數(shù)降低心力衰竭病人藥物干預療效的關系，以期為臨床治療慢性心力衰竭提供有效、可靠的治療方案并闡明藥物干預的部分作用機制，從而為進一步有效降低心力衰竭再住院率及其他不良事件發(fā)生率提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年3月—2017年6月我院住院并接受治療的射血分數(shù)降低心力衰竭(HFrEF)病人136例，均符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》[4]制定的慢性心力衰竭診斷標準，且左室射血分數(shù)(LVEF)<40%。其中男82例，女54例，年齡60～73(66.32±5.96)歲；原發(fā)性疾病：擴張型心肌病21例，缺血性心臟病87例，高血壓性心臟病22例，肺源性心臟病6例；紐約心臟病協(xié)會(NYHA)心功能分級：Ⅱ級63例，Ⅲ級51例，Ⅳ級22例。所有病人均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準 年齡>60歲；NYHA分級為Ⅰ～Ⅲ級；入院時肌酐(Cr)為133～451 μmol/L；LVEF<40%；血壓≥110/60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。

1.2.2 排除標準 血流動力學指標不穩(wěn)定；伴有甲狀腺功能亢進性心臟病、心源性休克、肺動脈重度高血壓、惡性腫瘤、已確定的遺傳性或原發(fā)性血管性水腫；采用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素治療、惡性心律失常；嚴重肝腎功能不全；血壓<110/60 mmHg，血清鉀>5.4 mmol/L；治療過程中出現(xiàn)嚴重不良反應或嚴重并發(fā)癥需要特殊處理。

1.3 治療方法 采用常規(guī)抗心力衰竭治療，包括休息、限鹽、限水。藥物治療：利尿劑托拉塞米，依據(jù)病人尿量調(diào)整劑量；螺內(nèi)酯20 mg，每日1次；依那普利片2.5 mg，每日1次(咳嗽病人更換為厄貝沙坦37.5 mg，每日1次)。心力衰竭癥狀好轉(zhuǎn)后盡早加用琥珀酸美托洛爾緩釋片11.875 mg，每日1次，同時根據(jù)病人心率、血壓等指標變化及時調(diào)整藥物劑量。治療時間為6個月。

1.4 觀察指標 ①收集病人一般資料，包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、吸煙史(定義為吸煙支數(shù)每日1支以上，且至少連續(xù)吸煙3個月)、心率、血壓。②生化指標：病人入院后抽取肘靜脈血13 mL，其中部分用于生化指標、聚合酶鏈式反應(PCR)檢測。采用美國羅氏公司生產(chǎn)的cobas8000全自動化免疫系統(tǒng)測定肝功能、腎功能；N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP，熒光素增強免疫化學發(fā)光法，試劑盒購自南京諾爾曼生物技術有限公司)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PPARγC1α，酶聯(lián)免疫吸附法，試劑盒購自美國R&D公司)。③心臟彩超：病人入院2 d內(nèi)完成心臟彩超檢查，采用HP5500型彩色多普勒超聲診斷儀，采用雙腔Simpson法測量LVEF、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPWT)。6個月后再次抽取病人肘靜脈血檢測上述生化指標，復查心臟彩超。

1.5 基因檢測方法

1.5.1 NRF-1基因+141 G/T多態(tài)性 將抽取到的病人血樣標本5 mL置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的EP管中，采用常規(guī)酚-氯仿法提取外周血樣本中基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度法確定DNA的濃度及純度(純度為A260/A280≥1.8)并保存于-80 ℃冰箱中備用，采用PCR-RFLP技術常規(guī)擴增外周血基因組DNA，按照Oligo 6軟件設計方案，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。NRF-1基因+141 G/T正向引物序列：5′-CGCTAGCTGGCTACGCGTACTACCG-3′，反向引物序列：5′-GTGCCGTAGCTAGCTACGATCGGC-3′。PCR擴增體系為25 μL，其中含有5 μL的PCR緩沖液，正向及反向引物各0.5 μL，5 U/L Taq DNA聚合酶0.25 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 4.0 μL，剩余加入雙蒸水。NRF-1基因+141 G/T擴增反應：反應條件為95 ℃預變性2min，之后按照94℃30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s順序進行40個循環(huán)，最后以62 ℃延伸4 min。PCR擴增產(chǎn)物長度為256 bp。所有樣本均在ABI-7500 fast RT-PCR電泳儀上進行，確定擴增樣品是否擴增成功。NRF-1基因+141 G/T多態(tài)位點的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bsp EI消化。酶切反應后，在含2%瓊脂糖凝膠電泳上電泳，確定酶切產(chǎn)物。隨機選取PCR產(chǎn)物，確定酶切反應效率。

1.5.2 實時熒光定量PCR檢測NRF-1、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A基因(mitochondrial transcription factor A mRNA，TFAM mRNA) 將抽取到的肘靜脈血3 mL采用Qiagen血液基因組RNA提取試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作提取病人RNA，利用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒對所提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，采用實時熒光定量PCR儀進行基因擴增(對照基因為GAPDH)，獲取TFAM特異性擴增曲線和溶解曲線。引物由上海生工生物工程有限公司設計、合成。NRF-1正向引物序列：5′-CGTACGTAGCTACGATCACCA-3′，反向引物序列：5′-AGCTGTCAGCTAGTACGTTACC-3′；TFAM正向引物序列：5′-GCGTGCGCGGCTCGATCGATCAGCTT-3′，反向引物序列：5′-GTCTACGCGTAGCTAGCTAGCATCAAC-3′；GAPDH正向引物序列：5′-TAGCGTAGCTGGGCTACACGTACATC-3′，反向引物序列：5′-CGCTAGCTGGATCAGACAGGTAACTAA-3′。PCR擴增體系為25 μL，其中含有5 μL的PCR緩沖液，正向及反向引物各0.5 μL，5 U/L Taq DNA聚合酶0.25 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 4.0 μL，其余加入雙蒸水。反應條件為：95 ℃預變性15 s，94 ℃變性20 s、63 ℃ 15 s退火、72 ℃延伸20 s，共進行40個循環(huán)。試驗數(shù)據(jù)采用目的基因Ct值與對照基因Ct值的比值作為TFAM mRNA表達水平。

1.6 隨訪 所有病人出院后1個月門診隨訪1次，之后每3個月經(jīng)門診或電話隨訪1次，至少隨訪2年。記錄所有病人隨訪期間心血管事件發(fā)生情況，包括心源性死亡(指心源性猝死及充血性心力衰竭引起的死亡)、心臟移植或惡性心律失常及慢性心力衰竭再住院情況。

1.7 臨床療效評定 顯效：治療后心力衰竭癥狀基本得到控制或心功能改善2級以上；有效：治療后心功能改善1級但未達到2級；無效：治療后心功能無明顯改善；惡化：治療后心功能進一步加重?？傆行?(顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 NRF-1基因+141 G/T基因擴增結(jié)果 基因檢測顯示，GG型為1條電泳條帶(128 bp)，GT為3條電泳條帶(128 bp、107 bp、21 bp)，TT為2條電泳條帶(107 bp、21 bp)。詳見圖1。

圖1 NRF-1基因+141 G/T基因擴增電泳圖及基因測序圖(A為基因電泳圖，通道1與通道4為GG基因型，通道2為GT基因型，通道3與通道5為TT基因型；B為GG基因型測序；C為GT基因型測序；D為TT基因型測序)

2.2 NRF-1基因+141 G/T基因型頻率分布及不同基因型臨床資料比較 136例病人中，GG基因型57例(41.91%)，GT基因型55例(40.44%)，TT基因型24例(17.65%)。3種基因型病人年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、吸煙史、血壓比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 不同基因型臨床資料比較

2.3 不同基因型臨床療效比較 3種基因型總有效率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=19.929，P<0.001)，GG、GT基因型總有效率均高于TT基因型，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 不同基因型臨床療效比較 單位：例(%)

2.4 3種基因型治療前后相關生化指標比較 治療后，3種基因型心率、LVEF、LVEDD、NT-proBNP、估算腎小球濾過率(eGFR)及PPARγC1α均優(yōu)于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；GG、GT基因型LVEF、LVEDD、NT-proBNP、eGFR、PPARγC1α優(yōu)于TT基因型，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表3。

表3 3種基因型治療前后相關生化指標比較(±s)

2.5 實時熒光定量PCR檢測NRF-1 mRNA、TFAM mRNA表達情況 RT-PCR檢測顯示，治療后，各基因型組NRF-1 mRNA、TFAM mRNA差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；治療后，GG、GT基因型與TT基因型NRF-1 mRNA、TFAM mRNA比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見圖2、表4。

圖2 RT-PCR檢測NRF-1 mRNA、TFAM mRNA表達情況(1為各基因型治療前；2為各基因型治療后)

表4 治療前后3種基因型NRF-1及TFAM mRNA表達比較(±s)

2.6 不同基因型心血管事件發(fā)生率比較 136例病人隨訪2年，心血管事件總發(fā)生率為25.74%(35/136)。GG、GT及TT型2年內(nèi)心血管事件發(fā)生率分別為19.30%、23.64%和45.83%。Kalplan-Meier法分析顯示，3種基因型累積心血管事件發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計學意義(Logrankχ2=6.706，P=0.035)。詳見圖3。

圖3 Kalplan-Meier法分析3種基因型2年內(nèi)心血管事件累積發(fā)生情況

2.7 預后影響因素分析 將預后是否出現(xiàn)心血管事件(是=1，否=0)為因變量，以相關特征因素及生化指標為自變量，采用Cox風險比例模型分析。結(jié)果顯示，TT基因型、NT-proBNP、LVEDD為預后的危險因素；NRF-1、TFAM及PPARγC1α、LVEF為預后的保護因素。詳見表5。

表5 心力衰竭病人心血管事件預后影響因素的Cox風險比例模型分析

3 討 論

心力衰竭的主要病理機制為心肌缺血缺氧引起的心肌細胞受損，心肌細胞壞死是導致心室重構(gòu)的重要原因。有研究顯示，心肌細胞能量代謝功能障礙在心力衰竭發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[5]。心肌細胞功能的主要細胞器是線粒體。NRF-1是由細胞色素C激活表達的，在細胞核、線粒體相互作用中發(fā)揮著重要作用[6]。NRF-1可調(diào)節(jié)細胞生長、凋亡及線粒體氧化呼吸[7]，且NRF-1高表達對減輕、預防心力衰竭的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。腦鈉肽(BNP)和NT-proBNP對心力衰竭及短期內(nèi)心血管不良事件有診斷價值，本研究從另一方面部分闡述了NRF-1基因及其多態(tài)性與心力衰竭治療后的臨床療效關系及遠期心血管事件發(fā)生情況的關系，探討心力衰竭治療是否與心肌細胞線粒體能量代謝有關，為今后臨床采取合理有效的治療有效提供方法，同時為進一步研發(fā)有效的治療藥物提供一定的理論依據(jù)。

NRF-1為轉(zhuǎn)錄激活線粒體中相關基因啟動子的核轉(zhuǎn)錄因子，定位于7號染色體3區(qū)2帶，由503個氨基酸組成。有研究顯示，NRF-1基因多態(tài)性與冠心病、2型糖尿病發(fā)病存在一定的相關性[8-9]，不同基因型對冠心病、糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展存在差異。目前NRF-1基因多態(tài)性是否與心力衰竭療效及預后有關的文獻報道較少。本研究結(jié)果顯示，NRF-1基因+141 G/T多態(tài)性與藥物治療后療效及遠期心血管事件發(fā)生均存在一定的相關性，提示NRF-1基因+141 G/T多態(tài)性與心力衰竭療效及預后可能存在一定聯(lián)系，值得進一步研究。缺氧條件下，NRF-1高表達有助于細胞存活，NRF-1基因具有改善細胞缺氧狀態(tài)、提高細胞活力的作用[3]；體外刺激心肌細胞NRF-1表達上調(diào)，可增加線粒體氧化磷酸化蛋白表達[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，NRF-1可強烈誘導PPARγC1α表達，形成共激活因子，作用于TFAM啟動基因，直接調(diào)控線粒體轉(zhuǎn)錄與復制[11]。本研究結(jié)果顯示，GG、GT基因型病人NRF-1 mRNA、TFAM mRNA表達水平高于TT基因型，表明不同基因型NRF-1存在能量代謝基因表達差異，可能是導致心肌細胞能量代謝功能障礙的重要原因及藥物干預預后差異的關鍵因素。

交感腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)(SAS)及腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在人體中發(fā)揮著重要的作用，其激活后過表達是導致心室重構(gòu)及慢性心力衰竭的重要原因[12]。盡管血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑及β受體阻滯劑阻斷了SAS和RAS過度激活，仍有部分病人未從藥物干預中獲益[13]。分子研究顯示，多數(shù)抗心力衰竭藥物與特定靶蛋白結(jié)合發(fā)揮著生物學作用，編碼這些藥物作用靶位的基因多表現(xiàn)為多態(tài)性，基因多態(tài)性影響藥物治療敏感性[14]。有研究顯示，RAS過度激活導致血管緊張素Ⅱ高表達，進而引起線粒體損傷，導致NRF-1、TFAM基因表達下調(diào)[15]；β腎上腺素受體興奮導致心肌細胞損傷，其作用機制可能與抑制線粒體NRF-1表達有關[16]。上述研究表明，NRF-1可能為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或β受體阻滯劑的潛在作用靶點。本研究結(jié)果顯示，NRF-1基因+141 G/T不同基因型表現(xiàn)不同臨床療效。GG、GT基因型病人經(jīng)藥物后總有效率明顯高于TT基因型，且LVEF、PPARγC1α、eGFR水平高于TT基因型，NT-proBNP水平低于TT基因型，提示NRF-1基因+141 G/T中TT基因型病人經(jīng)藥物治療后效果較差，其可能與NT-proBNP水平降低不明顯有關，值得進一步研究，同時結(jié)果表明不同基因型對藥物治療的敏感性存在差異。

本研究進一步明確NRF-1基因+141 G/T不同基因型與心血管事件發(fā)生率的關系，以期為臨床采取合理有效的治療方案提供依據(jù)。結(jié)果顯示，GG、GT基因型心血管事件發(fā)生率低于TT基因型，經(jīng)Cox風險比例模型分析顯示，TT基因型為預后獨立危險因素。雖然本研究闡明了慢性心力衰竭預后與NRF-1、TFAM及PPARγC1α的關系，但未進一步明確NRF-1基因+141 G/T多態(tài)性與心力衰竭作用及藥物干預機制及對心肌細胞及心肌細胞線粒體功能的影響，需進一步行體外研究或動物實驗探討相關作用機制，進而闡明藥物的作用效果。

綜上所述，NRF-1基因+141 G/T多態(tài)性與慢性心力衰竭病人療效有關，與2年內(nèi)心血管事件發(fā)生情況有一定的相關性，其作用可能與藥物干預后提高NRF-1、TFAM基因及PPARγC1α表達有關。