趙燁婧，彭紅玉，劉建勛，柳景華

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病歸屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛病”范疇，其中急性冠脈綜合征為兇險(xiǎn)和嚴(yán)重的一種類型[1]。心氣充沛、氣血調(diào)和，才能保證心臟正常的生理功能。若心氣虧虛或瘀滯，則血行無(wú)力，乃致血停成瘀，強(qiáng)調(diào)胸痹心痛的病機(jī)關(guān)鍵在于血瘀，而氣滯血瘀證和氣虛血瘀證是氣血失和的兩種重要表現(xiàn)類型，均是形成冠心病血瘀證候的重要病理生理機(jī)制[2-4]。兩者表現(xiàn)為相同血瘀證的客觀征象同時(shí)，微觀層面是否具有各自獨(dú)特的病理生理變化或分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。隨著基因表達(dá)芯片技術(shù)及生物信息學(xué)方法的蓬勃發(fā)展，越來(lái)越多的基礎(chǔ)研究致力于探討中醫(yī)宏觀證候與微觀物質(zhì)基礎(chǔ)、分子機(jī)制調(diào)控之間的相互聯(lián)系，微小RNAs(microRNAs，miRNAs)的發(fā)現(xiàn)和不斷發(fā)展為豐富現(xiàn)代中醫(yī)理論提供了新的切入點(diǎn)。相關(guān)研究證實(shí)，miRNAs與冠心病關(guān)系密切，且在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，且miRNAs的表達(dá)具有時(shí)序性、特異性，這種表達(dá)特點(diǎn)與中醫(yī)“證”反映的機(jī)體病理狀態(tài)吻合，miRNAs表達(dá)異常引起相應(yīng)基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控紊亂是導(dǎo)致疾病發(fā)生的重要內(nèi)在原因[5-6]。因此，本研究以急性冠脈綜合征氣滯血瘀證、氣虛血瘀證病人為研究對(duì)象，利用基因表達(dá)芯片技術(shù)及生物信息學(xué)方法，對(duì)氣滯血瘀證和氣虛血瘀證病人循環(huán)miRNAs表達(dá)譜變化進(jìn)行分析，并對(duì)差異miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)及功能分析，旨在從微觀層面進(jìn)一步闡明血瘀證不同亞型的病理生理機(jī)制，為冠心病辨證分型提供客觀依據(jù)和理論支持。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究依托于973計(jì)劃(No.2015CB554404)，研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.2015031)且所有病人均自愿參與本研究并簽署知情同意書(shū)。選取2017年4月—2018年7月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院擬行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)治療的急性冠脈綜合征病人10例，其中氣滯血瘀證5例，氣虛血瘀證5例。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡18～80歲；符合急性冠脈綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)；中醫(yī)辨證為氣滯血瘀證或氣虛血瘀證；所有病人均簽署知情同意書(shū)；臨床資料及相關(guān)數(shù)據(jù)完整。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 嚴(yán)重腎功能不全，血清肌酐男性>220 μmol/L，女性>175 μmol/L；患有明顯的肝臟疾病或轉(zhuǎn)氨酶高于正常上限3倍；嚴(yán)重心、肺功能不全；未控制的Ⅲ級(jí)高血壓病人[治療后收縮壓>160 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，舒張壓>100 mmHg]；合并急性腦血管疾病或嚴(yán)重瓣膜性心臟??；嚴(yán)重造血系統(tǒng)疾病；嚴(yán)重精神類疾病病人；妊娠或準(zhǔn)備妊娠婦女，哺乳期婦女；惡性腫瘤或病人預(yù)期壽命<3年；病人拒絕簽署知情同意書(shū)，或估計(jì)依從性較差、隨訪可能性差；近3個(gè)月內(nèi)參加過(guò)或正在參加其他臨床試驗(yàn)。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 急性冠脈綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2013年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)(ACCF)/美國(guó)心臟學(xué)會(huì)(AHA)ST段抬高型心肌梗死管理指南[7]和2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)制定的非ST段抬高型急性冠脈綜合征診治指南[8]。

1.3.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照1990年中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)心血管病專業(yè)委員會(huì)制定的冠心病中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)[9]。

1.4 研究方法

1.4.1 一般資料 收集并詳細(xì)記錄入選病人臨床資料，包括性別、身高、體重、血壓、心率及是否合并高血壓、糖尿病、高脂血癥、腎功能不全、吸煙史等既往史。

1.4.2 血液標(biāo)本采集 于病人入院后次日清晨抽取空腹靜脈血6～8 mL，血液樣本待自然凝固30 min后，以3 000 r/min離心10 min，留取上層血清，凍存-80 ℃低溫冰箱備用。

1.4.3 miRNAs提取與質(zhì)檢 使用mirvannatm PARISTM試劑盒從血漿中提取總RNA，利用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific)定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)檢測(cè)RNA完整性。

1.4.4 miRNAs芯片高通量篩選 RNA質(zhì)檢合格后，將提取血清總RNA進(jìn)行靶標(biāo)制備，總RNA逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA，再進(jìn)一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)標(biāo)記的cRNA。標(biāo)記好的cRNA與芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)掃描得到原始圖像。采用Feature Extraction 軟件(version 10.7.1.1，Agilent Technologies)處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)，進(jìn)一步對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行quantile標(biāo)準(zhǔn)化及數(shù)據(jù)過(guò)濾。用于比較的每組樣本中至少1組100%標(biāo)記為Detected的探針留下進(jìn)行后續(xù)分析。利用t檢驗(yàn)的P值和Fold-change法篩選差異表達(dá)的miRNAs，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P值≤0.05。

1.4.5 差異miRNAs靶基因預(yù)測(cè) 通過(guò)miRDB和miRWalk兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNAs的靶基因。miRWalk是基于軟件學(xué)習(xí)的miRNAs靶基因預(yù)測(cè)算法TarPmiR預(yù)測(cè)miRNAs-mRNAs的靶基因關(guān)系對(duì)；miRDB是基于機(jī)器學(xué)習(xí)的miRNAs靶基因預(yù)測(cè)算法miRTarg內(nèi)皮素預(yù)測(cè)miRNAs可能的靶基因，最終獲取數(shù)據(jù)庫(kù)的交集基因進(jìn)行分析。

1.4.6 基因功能富集與信號(hào)通路分析 利用The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery(DAVID)平臺(tái)(https://david.ncifcrf.gov/)中的基因本體(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集與信號(hào)通路分析，判定差異miRNAs影響的細(xì)胞分子通路或生物學(xué)功能。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組年齡、性別比例、體質(zhì)指數(shù)、血壓、既往病史、吸煙史及Gensini評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 氣滯血瘀證組和氣虛血瘀證組差異性表達(dá)的miRNAs 氣滯血瘀證組和氣虛血瘀證組血清miRNAs表達(dá)微陣列經(jīng)掃描和數(shù)據(jù)分析，以相對(duì)表達(dá)水平差異倍數(shù)≥ 2.0且P值≤0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出13個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，包括11個(gè)表達(dá)上調(diào)的miRNAs和2個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNAs，火山圖詳見(jiàn)圖1。上調(diào)的miRNAs包括miR-7111-3p、miR-4515、miR-4436b-5p、miR-6743-3p、miR-4664-3p、miR-7974、miR-4646-3p、miR-6760-3p、miR-6507-3p、miR-6731-3p、miR-7114-3p和下調(diào)的miRNAs包括miR-3656、miR-4442，聚類圖詳見(jiàn)圖2。

圖1 氣滯血瘀證組和氣虛血瘀證組差異表達(dá)miRNAs火山圖

圖2 氣滯血瘀證組和氣虛血瘀證組差異表達(dá)miRNAs聚類圖

2.3 差異性表達(dá)miRNAs的靶基因預(yù)測(cè) 通過(guò)miRDB和miRWalk兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)共同對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，共篩選出175個(gè)miRNAs-mRNA關(guān)系對(duì)，詳見(jiàn)圖3。靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 差異miRNAs靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)Venn圖

表2 差異性表達(dá)的miRNAs及預(yù)測(cè)的靶基因結(jié)果

2.4 靶基因GO富集分析 本研究對(duì)差異表達(dá)靶基因分別進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分的GO富集分析。結(jié)果表明，氣滯血瘀證組和氣虛血瘀證組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNAs預(yù)測(cè)靶基因主要參與生物過(guò)程調(diào)控、代謝調(diào)控、多細(xì)胞器官的發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控等過(guò)程。詳見(jiàn)圖4。

圖4 差異miRNAs靶基因GO富集分析

2.5 靶基因KEGG富集分析 KEGG富集分析結(jié)果顯示，這些差異靶基因在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Apelin信號(hào)通路富集，尤其在PI3K/Akt信號(hào)通路最顯著，詳見(jiàn)圖5。結(jié)果提示冠心病氣血失和證候形成的病理生理機(jī)制與這些通路密切相關(guān)，與氣滯血瘀證相比，PI3K/Akt信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Apelin信號(hào)通路在氣虛血瘀證中表現(xiàn)為顯著下調(diào)。

圖5 差異miRNAs靶基因KEGG富集分析

3 討 論

中醫(yī)理論體系中氣和血為機(jī)體重要的物質(zhì)和能量基礎(chǔ)，中醫(yī)所言“氣為血之帥，血為氣之母”，氣血調(diào)和為生命之本，氣血失常為百病之機(jī)。既往文獻(xiàn)顯示，氣滯血瘀證和氣虛血瘀證作為氣血失和重要的兩種表現(xiàn)類型，均為冠心病的核心病機(jī)[10]。目前臨床氣血辨證方法多數(shù)以經(jīng)驗(yàn)為主，對(duì)氣滯血瘀證和氣虛血瘀證的微觀物質(zhì)基礎(chǔ)未獲得統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多研究運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)探討中醫(yī)證候的生物學(xué)本質(zhì)和病理生理機(jī)制，有利于中醫(yī)證候理論的深化和推廣。

miRNAs是一類長(zhǎng)20～24 nt的內(nèi)源性非編碼核糖核酸分子，主要通過(guò)識(shí)別靶基因3′非翻譯區(qū)的靶位點(diǎn)介導(dǎo)mRNA降解或翻譯抑制發(fā)揮作用。這類miRNAs在進(jìn)化上具有高度的保守性，表達(dá)具有時(shí)間和組織特異性，是調(diào)節(jié)其他功能基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)分子，在生物體的各種生命過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[11-12]。中醫(yī)領(lǐng)域里，通過(guò)探索相關(guān)靶標(biāo)miRNAs分子，尋找宏觀證候與微觀物質(zhì)基礎(chǔ)的特定聯(lián)系。有研究顯示，miRNAs在血瘀證等中醫(yī)證候的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用，其表達(dá)變化不僅可協(xié)助診斷，還可預(yù)測(cè)與疾病相關(guān)的分子信號(hào)機(jī)制[13-15]。本研究通過(guò)選擇miRNAs芯片，利用其快速、平行、高通量的檢測(cè)特點(diǎn)，以氣滯血瘀證和氣虛血瘀證急性冠脈綜合征病人為研究對(duì)象，通過(guò)現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法分析氣滯血瘀證和氣虛血瘀證不同的微觀生物基礎(chǔ)及潛在的病理生理機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組血清存在13個(gè)差異性表達(dá)的miRNAs，包括11個(gè)表達(dá)上調(diào)的miRNAs和2個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNAs。廣泛參與信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程、生物過(guò)程調(diào)控等病理過(guò)程，進(jìn)一步對(duì)差異靶基因行功能富集分析，結(jié)果顯示這些差異靶基因在PI3K/Akt信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Apelin信號(hào)通路差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尤其在PI3K/Akt信號(hào)通路富集最為明顯。

既往研究已證實(shí)，PI3K/Akt/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)信號(hào)通路與冠心病的病理生理過(guò)程密切相關(guān)，PI3K激活導(dǎo)致Akt的磷酸化，被激活的PI3K/Akt通過(guò)調(diào)節(jié)Ser1177上的eNOS磷酸化，并與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體結(jié)合激活eNOS，之后催化L-精氨酸脫氨基產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide，NO)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移，參與血管收縮、血管平滑肌細(xì)胞增生、血管重塑和機(jī)能障礙等病理過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成[16-17]。本研究結(jié)果顯示，與氣滯血瘀證病人相比，氣虛血瘀證病人可能通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路，引起血管內(nèi)皮功能障礙、血管痙攣、異常收縮、血栓形成及血管增生等病理生理過(guò)程的形成。與既往研究證實(shí)氣虛血瘀證冠心病存在血管內(nèi)皮功能異常，并貫穿發(fā)生發(fā)展過(guò)程的始終觀點(diǎn)一致，且主要表現(xiàn)為NO和內(nèi)皮素-1分泌失衡，血清NO/內(nèi)皮素降低在氣虛血瘀證病人尤為明顯[18-19]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)冠心病氣虛血瘀證小鼠采用雪蓮?fù)}丸等補(bǔ)氣活血的中藥治療，通過(guò)升高血清NO水平、降低內(nèi)皮素-1水平可改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)和心肌缺血[20]。既往研究未完全闡明氣虛血瘀證的基因作用通路，本研究結(jié)果推測(cè)上調(diào)PI3K/Akt通路以升高血清NO/內(nèi)皮素含量可能是補(bǔ)氣活血方改善氣虛血瘀證小鼠內(nèi)皮功能障礙的內(nèi)在機(jī)制，仍需進(jìn)一步對(duì)篩選出的差異miRNAs進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和多中心、大樣本的臨床研究驗(yàn)證。

綜上所述，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法共篩選出氣虛血瘀證和氣滯血瘀證冠心病病人13個(gè)差異表達(dá)miRNAs可能參與氣血失和證冠心病的發(fā)生和發(fā)展，進(jìn)一步功能分析發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt等信號(hào)通路下調(diào)可能參與氣虛血瘀證冠心病病理生理機(jī)制的形成。該結(jié)果對(duì)進(jìn)一步尋求中醫(yī)證候生物學(xué)本質(zhì)及標(biāo)志物提供了一定的基礎(chǔ)理論依據(jù)。