申俊杰，李愛(ài)萍，申銘，馬國(guó)瑞

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科，湖北 武漢430030

肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)是肝臟手術(shù)、創(chuàng)傷及失血性休克后發(fā)生肝衰竭的重要原因。目前研究認(rèn)為HIRI的發(fā)生與鈣超載、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮素及補(bǔ)體系統(tǒng)、代謝性酸中毒等多種因素相關(guān)[1]，因而探索新的保護(hù)HIRI的藥物至關(guān)重要。百里醌(thymoquinone，TQ)是一種具有抗氧化、抗炎癥作用的天然化合物，對(duì)糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化的防治具有較好的效果。而且，百里醌對(duì)人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、前列腺上皮細(xì)胞、小腸細(xì)胞等正常細(xì)胞無(wú)毒性損害[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，百里醌能預(yù)防HIRI，但其具體機(jī)制不明。因此，本研究將進(jìn)一步探討百里醌通過(guò)抑制凋亡、抗氧化應(yīng)激等改善HIRI的具體分子機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用200～250 g重量SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，均購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。完成該實(shí)驗(yàn)所有動(dòng)物操作均符合動(dòng)物試驗(yàn)倫理要求。

二、材料和試劑

百里醌(Sigma公司，美國(guó))用無(wú)菌無(wú)水乙醇配制成10 mmol/L的儲(chǔ)存液，-20 ℃保存。Bax、Bcl-2、裂解的胱天蛋白酶(Cleaved-caspases)-3、Cleaved-caspases-9、β-actin抗體購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)公司。LKB1、磷酸化(p)-LKB1(Ser428)、AMPK、p-AMPK[酪氨酸(Thr)172]多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Novus公司。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自武漢華美生物有限公司。大鼠丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。肝臟細(xì)胞凋亡采用原位末端標(biāo)記(TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物科技公司)。

三、HIRI模型

用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)鼠，參照Kohli等[3]的方法，分離肝血管和膽管，以血管夾臨時(shí)性?shī)A閉肝左葉、肝中葉的血管，45 min后去掉血管夾，恢復(fù)肝臟血液供應(yīng)，最終導(dǎo)致70%肝臟組織缺血再灌注損傷，缺血再灌注期間不阻斷右肝及尾狀葉血流。

四、實(shí)驗(yàn)分組

將SD大鼠依照體質(zhì)量編號(hào)，并采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分組。假手術(shù)組(Sham組，n=10)：解剖供應(yīng)左肝和中肝的肝蒂，但不阻斷血流；缺血再灌注組(IRI組，n=10)：手術(shù)中血管夾封閉包含肝左葉、中葉血管的肝蒂，阻斷45 min后再灌注，縫合切口，正常飲食喂養(yǎng)24 h。百里醌預(yù)處理+肝缺血再灌注組(TQ+IRI組，各亞組n=10)：術(shù)前1周分別給予不同濃度百里醌(5、10、25、50、100 mg/kg)灌胃給藥，手術(shù)中血管夾封閉包含肝左葉、中葉血管的肝蒂，阻斷45 min后再灌注，縫合切口，正常飲食喂養(yǎng)24 h，同時(shí)繼續(xù)給予以上不同濃度百里醌灌胃。術(shù)后24 h抽取其中5只大鼠血樣，并處死實(shí)驗(yàn)鼠，新鮮肝臟組織生理鹽水洗凈后液氮凍存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析；剩余5只實(shí)驗(yàn)鼠繼續(xù)正常喂養(yǎng)1周后，處死并提取肝臟組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。

五、ELISA檢測(cè)

術(shù)后24 h抽取實(shí)驗(yàn)鼠血液，經(jīng)3 000 r/min 離心10 min，分離血清，ALT、AST水平采用大鼠ALT、AST ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定；術(shù)后24 h處死實(shí)驗(yàn)鼠，提取新鮮肝臟組織，參考GPX、GSH、SOD、MDA ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)操作與結(jié)果測(cè)定。

六、蛋白印跡法(Western blotting)

術(shù)后24 h提取實(shí)驗(yàn)鼠肝臟組織，裂解液勻漿并提取組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，40 g總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉非特異性位點(diǎn)。一抗4 ℃孵育過(guò)夜，再經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育1 h，采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖片。以β-actin蛋白為內(nèi)參對(duì)照，實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

七、組織病理學(xué)研究

取適量新鮮實(shí)驗(yàn)鼠肝臟組織，預(yù)冷生理鹽水洗凈血液，于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察肝臟組織的受損情況(壞死、炎性浸潤(rùn)等)，采用Suzuki評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肝損傷的組織學(xué)評(píng)估。

八、Ki67免疫組織化學(xué)

大鼠在手術(shù)干預(yù)后繼續(xù)飼養(yǎng)1周，提取肝臟組織行石蠟包埋、切片并經(jīng)過(guò)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后行Ki67抗體免疫組織化學(xué)染色。以細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯的棕黃色染色為陽(yáng)性信號(hào)。每張切片在5個(gè)隨機(jī)高倍視野(×400)中進(jìn)行肝細(xì)胞計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)平均陽(yáng)性率，以百分?jǐn)?shù)表示。

九、TUNEL染色

大鼠肝組織石蠟切片經(jīng)過(guò)脫蠟、蛋白酶K及過(guò)氧化氫滅活、生物素標(biāo)記及3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。每張切片在5個(gè)隨機(jī)高倍視野(×400)中進(jìn)行肝細(xì)胞計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)平均陽(yáng)性率，以百分?jǐn)?shù)表示。

十、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、百里醌預(yù)處理對(duì)預(yù)防HIRI的效果

不同濃度梯度百里醌對(duì)SD大鼠HIRI的保護(hù)作用隨濃度增加而效果增加，在50 mg/kg濃度為最佳，其后增加百里醌濃度并無(wú)明顯肝保護(hù)效果累積，后續(xù)選取百里醌50 mg/kg為試驗(yàn)濃度(圖1A、1B)。IRI組與Sham組比較，大鼠血清ALT[(171.7±11.6) U/L比(21.5±3.51) U/L，P<0.05)]、AST[(194.7±13.5) U/L比(26.4±3.97) U/L，P<0.05)]水平明顯上升，表面肝細(xì)胞受損明顯。百里醌預(yù)處理后，與Sham組比較肝臟缺血再灌注仍存在較明顯的肝細(xì)胞損傷，ALT和AST水平較Sham組有上升(P<0.05)，但TQ+IRI組與IRI組比較，ALT[(67.3 ±5.8) U/L比(171.7±11.6) U/L，P<0.05]、AST[(57.9±6.1) U/L比(194.7±13.5) U/L，P<0.05]水平明顯下調(diào)，結(jié)果初步判定百里醌能夠減輕HIRI，有效保護(hù)肝細(xì)胞(圖1A、1B)。

注：aP<0.05；與IRI組比較，bP<0.05，cP<0.01，NS.P>0.05。圖1 百里醌(TQ)預(yù)處理預(yù)防肝臟缺血再灌注損傷(IRI) A.血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平改變；B.天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平改變

二、各組大鼠肝組織病理學(xué)染色觀察結(jié)果

如圖2所示，在Sham組大鼠肝臟組織中，我們可以觀察到清晰的肝小葉結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)肝細(xì)胞壞死。而IRI組大鼠肝臟組織中，可見(jiàn)不同程度的肝細(xì)胞腫脹、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中央靜脈的淤血伴隨肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，出現(xiàn)了明顯的肝損傷表現(xiàn)。而TQ+IRI組大鼠肝臟中肝小葉結(jié)構(gòu)尚清晰，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少于IRI組，肝臟細(xì)胞變性腫脹程度較輕，點(diǎn)狀壞死灶明顯減少。

圖2 各組大鼠肝臟組織的HE染色及病理學(xué)結(jié)果 A.假手術(shù)組(Sham組)；B.缺血再灌注組(IRI組)；C.百里醌預(yù)處理+肝缺血再灌注組(TQ+IRI組)

TUNEL染色評(píng)估大鼠肝臟細(xì)胞壞死程度，IRI組在術(shù)后24 h、7 d的TUNEL染色后凋亡指數(shù)均明顯高于TQ+IRI組(圖3，P<0.01)，7 d后相對(duì)Sham組也有顯著增高。結(jié)果表明IRI導(dǎo)致明顯急性慢性肝細(xì)胞壞死，百里醌預(yù)處理減少了肝臟急性損害。

注：Sham.假手術(shù)組；IRI.缺血再灌注組；TQ+IRI.百里醌預(yù)處理+肝缺血再灌注組；aP<0.05；bP<0.01。圖3 術(shù)后24 h、7 d各組大鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

本研究進(jìn)一步采用Ki67染色來(lái)評(píng)估大鼠肝臟組織在缺血再灌注損傷后的炎性反應(yīng)及肝臟細(xì)胞再生能力(Ki67可以反應(yīng)細(xì)胞增殖)，如圖4所示，各組大鼠在干預(yù)24 h后提取肝臟組織并行Ki67染色，發(fā)現(xiàn)組間Ki67指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而IRI組術(shù)后7 d的大鼠肝臟組織中Ki67陽(yáng)性肝細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯高于Sham組大鼠，說(shuō)明肝臟中存在較多的肝細(xì)胞再生，而TQ+IRI組Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于IRI組，表明百里醌預(yù)處理能夠明顯促進(jìn)肝臟細(xì)胞的再生。

注：Sham.假手術(shù)組；IRI.缺血再灌注組；TQ+IRI.百里醌預(yù)處理+肝缺血再灌注組；aP<0.05；bP<0.01。圖4 術(shù)后24 h、7 d各組大鼠肝臟組織Ki67染色分析

三、百里醌對(duì)HIRI中細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

與Sham組比較，IRI組大鼠肝臟中GPX、SOD含量均顯著下調(diào)(圖5A～C，P<0.05)，表明缺血再灌注導(dǎo)致肝臟組織抗氧化應(yīng)激能力下降[HIRI激活肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，而氧化應(yīng)激損傷是由活性氧家族(ROS)造成的，GPX、SOD是機(jī)體清除ROS的重要酶系]。TQ+IRI組大鼠肝臟組織中GPX、SOD水平較IRI組明顯上調(diào)(圖5A～C，P<0.05)，表明百里醌預(yù)處理增強(qiáng)肝臟細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激損傷能力。IRI組與Sham組比較，MDA含量明顯增加，百里醌預(yù)處理能顯著抑制缺血再灌注導(dǎo)致的肝臟組織MDA含量上升，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5D，P<0.05)。

注：Sham.假手術(shù)組；IRI.缺血再灌注組；TQ+IRI.百里醌預(yù)處理+肝缺血再灌注組；aP<0.05。圖5 缺血再灌注損傷(IRI)后大鼠肝組織的抗氧化酶活性變化 A.谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)活性；B.谷胱甘肽(GSH)水平；C.超氧化物歧化酶(SOD)活性；D.丙二醛(MDA)水平

四、百里醌預(yù)處理、缺血再灌注對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響

如圖6所示，與Sham組相比，缺血再灌注后肝臟組織中大鼠促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著上調(diào)、凋亡抑制蛋白Bcl-2明顯下調(diào)。TQ+IRI組大鼠肝細(xì)胞與Sham組比較，凋亡相關(guān)Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)有不同程度上調(diào)，但較IRI組顯著下降。

注：缺血再灌注組(IRI)與假手術(shù)組(Sham)比較，aP<0.05；百里醌預(yù)處理(TQ)+肝IRI組與IRI組比較，bP<0.05。圖6 蛋白印跡法分析百里醌預(yù)處理抑制肝臟缺血再灌注細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白變化(n=3) A.蛋白印跡法分析蛋白表達(dá)；B.蛋白表達(dá)量的相對(duì)灰度值比較分析

五、百里醌激活LKB1、AMPK信號(hào)通路抑制HIRI

如圖7所示，IRI組大鼠與Sham組比較，LKB1、AMPK蛋白表達(dá)總量無(wú)明顯改變，p-LKB1(Ser428)、p-AMPK(Thr172)水平明顯下調(diào)(P<0.05)。通過(guò)給予百里醌預(yù)處理后與IRI組及Sham組比較，肝臟組織的p-LKB1(Ser428)、p-AMPK(Thr172)蛋白磷酸化水平明顯上調(diào)，LKB1、AMPK激活明顯(TQ+IRI組比IRI組，P<0.05)。

注：Sham.假手術(shù)組；IRI.缺血再灌注組；TQ+IRI. 百里醌預(yù)處理+肝缺血再灌注組；與Sham組比較，aP<0.05；與IRI組比較，bP<0.05。圖7 蛋白印跡法分析各組大鼠肝臟組織中LKB1、p-LKB1(Ser428)、p-AMPK(Thr172)蛋白的表達(dá)(n=3) A.蛋白印跡法分析蛋白表達(dá)；B.蛋白表達(dá)量的相對(duì)灰度值比較分析

討 論

HIRI發(fā)生在肝移植、復(fù)雜的肝切除、失血性休克中，肝臟損傷程度主要?dú)w因于長(zhǎng)時(shí)間肝缺血和再灌注后肝損傷[4]。HIRI可分為熱缺血再灌注損傷與冷缺血再灌注損傷，熱缺血再灌注損傷多見(jiàn)于肝葉切除、失血性休克、靜脈閉塞性疾病等，這在臨床中更為常見(jiàn)和棘手。HIRI涉及眾多機(jī)制，其中肝細(xì)胞凋亡[5]、氧化應(yīng)激損傷[5]、炎性反應(yīng)[6-7]、肝竇Kupffer細(xì)胞代謝障礙[8]等，本研究主要評(píng)估在熱缺血再灌注損傷后肝細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷情況。

熱缺血再灌注損傷中，肝臟ROS的大量生成和ROS清除障礙產(chǎn)生的氧化應(yīng)激是加重肝臟損傷的重要因素，其中細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的消耗、合成降低是主要原因。在正常生理狀態(tài)下，肝臟超氧化物可以被肝細(xì)胞各種線粒體ROS清除機(jī)制不斷消減，這些清除機(jī)制包括SOD、GSH、GPX等[9]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)百里醌預(yù)處理能調(diào)控SOD、GSH、GPX的消除過(guò)程，進(jìn)而保障細(xì)胞內(nèi)ROS清除效率，從而增強(qiáng)肝細(xì)胞的自我保護(hù)與自我修復(fù)能力。此外，脂質(zhì)過(guò)氧化是引起ROS介導(dǎo)的HIRI的重要機(jī)制，所謂脂質(zhì)過(guò)氧化，是肝細(xì)胞ROS損害細(xì)胞膜及各種酶的不飽和脂肪酸側(cè)鏈，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，生成大量脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生嚴(yán)重破壞[10]。MDA系脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物，它的含量水平能間接反應(yīng)組織氧化應(yīng)激損傷程度。本研究中，百里醌能夠促進(jìn)MDA的生成，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物產(chǎn)量以減輕HIRI。

前期非酒精性脂肪肝大鼠模型中我們發(fā)現(xiàn)百里醌能夠激活A(yù)MPK信號(hào)。本研究通過(guò)給予百里醌預(yù)處理后肝臟組織的p-LKB1(Ser428)、p-AMPK(Thr172)蛋白磷酸化水平明顯上調(diào)，LKB1、AMPK激活明顯，這表明LKB1/AMPK的激活在百里醌預(yù)處理后的肝臟保護(hù)中發(fā)揮重要作用。目前有關(guān)HIRI的保護(hù)研究發(fā)現(xiàn)，除外類似在一項(xiàng)離體HIRI模型的研究中，發(fā)現(xiàn)敲除Bax基因，可明顯減輕肝細(xì)胞損傷的研究[11]，大部分集中在肝臟缺血預(yù)處理[12]、亞低溫處理[13]、硫化氫氣體或氫氣處理[14]、藥物的干預(yù)研究。而又以藥物的研究最為深入，主要涉及鈣離子通道的阻滯、炎性介質(zhì)及蛋白酶異常釋放的控制、氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)、微循環(huán)的改善及中草藥提取物的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，百里醌預(yù)處理能有效阻斷IRI的促凋亡，伴隨Bax蛋白下調(diào)、Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，有效減輕肝臟細(xì)胞凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)，TQ+IRI組大鼠肝細(xì)胞與Sham組比較，凋亡相關(guān)Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)有不同程度上調(diào)，但較IRI組則顯著下降，這表明百里醌預(yù)處理能在一定程度上有效阻斷缺血再灌注誘導(dǎo)的干細(xì)胞凋亡。

百里醌是從黑種草植物中提取的一種活性物質(zhì)[2]，眾多研究已表明百里醌具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、肝臟保護(hù)、抗高血壓、降血糖、解除氣道痙攣等作用[15-18]。且百里醌安全性高，在健康小鼠中口服喂養(yǎng)百里醌，其半數(shù)致死量(LD50)高于2 400 mg/kg[19]。在毒性肝損傷模型研究中，百里醌多是通過(guò)抗氧化、抗炎、抗肝纖維化、抗肝細(xì)胞凋亡等發(fā)揮護(hù)肝作用[20]?，F(xiàn)階段，關(guān)于百里醌對(duì)HIRI的研究較少，在本研究中，我們證實(shí)了百里醌預(yù)處理能夠有效預(yù)防缺血再灌注對(duì)大鼠肝臟組織的損傷，而這有可能是通過(guò)百里醌阻斷缺血再灌注誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這對(duì)臨床中缺血再灌注損傷導(dǎo)致的肝臟、心臟、腦、腎臟等損害研究均有啟迪意義。