李雯 曹興 葉長華

中南大學愛爾眼科學院 長沙愛爾眼科醫(yī)院，長沙 410004

李雯現(xiàn)在湖南省兒童醫(yī)院眼科，長沙 410007

青光眼是全球主要的不可逆性致盲眼病，以進行性視神經(jīng)損害和視野缺損為共同特征[1-2]。盡管當前對遺傳、神經(jīng)營養(yǎng)、篩板處改變、炎癥損害等青光眼發(fā)病機制方面的研究越來越多，但高眼壓仍是青光眼關鍵的危險因素，對青光眼的發(fā)生和發(fā)展至關重要[3]。高眼壓導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡和視神經(jīng)損傷，其作用機制復雜，尚未完全闡明。血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)為視網(wǎng)膜的免疫赦免提供了解剖學基礎，對視網(wǎng)膜微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)調節(jié)及正常視功能維持具有重要作用。因此，高眼壓是否通過破壞BRB改變視網(wǎng)膜微環(huán)境，從而對視網(wǎng)膜造成損傷值得探討。目前國內外關于急性高眼壓對BRB破壞的研究主要集中在血-視網(wǎng)膜內屏障(inner blood-retinal barrier，iBRB)，而其對血-視網(wǎng)膜外屏障(outer blood-retinal barrier，oBRB)破壞的研究報道較少見。本實驗擬從oBRB破壞的角度探討高眼壓損傷視網(wǎng)膜的病理機制，為青光眼發(fā)病機制及治療手段研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及分組 選取SPF級雄性C57BL/6J小鼠57只，體質量24～27 g，購自湖南斯萊克景達公司，均在12 h明暗循環(huán)、室溫22～25 ℃、相對濕度為(50±5)℃的環(huán)境中飼養(yǎng)。采用隨機數(shù)表法將小鼠隨機分為對照組和高眼壓組，其中對照組25只，高眼壓組32只，剔除建模失敗或建模不佳的小鼠后，每組最終納入20只，均以左眼為實驗眼。本研究按照視覺與眼科研究協(xié)會指南進行，經(jīng)長沙愛爾眼科醫(yī)院倫理委員會審核批準(批文號：2018-KYPJ005)。

1.1.2主要試劑及儀器 質量分數(shù)1%托吡卡胺滴眼液、鹽酸奧布卡因滴眼液(日本參天株式會社)；FAS固定液(武漢賽維爾生物公司)；OCT包埋劑(美國Sakura Finetek公司)；兔抗小鼠緊密連接蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)抗體(ab96587)、山羊抗兔IgG Cy5(ab97077)(英國Abcam公司)；DAPI(美國Vector公司)。TonoLab眼壓計(芬蘭Icare Finland Oy公司)；動物OCT眼科成像儀Micron Ⅳ(美國Phoenix Research Labs公司)；冷凍切片機(美國Thermo公司)；立體顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1急性高眼壓誘導視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷小鼠模型的建立 采用腹腔內注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉小鼠，1%托吡卡胺滴眼液點眼擴瞳，5 min后采用質量分數(shù)0.5%鹽酸奧布卡因滴眼液點眼進行局部麻醉。將連接無菌質量分數(shù)0.9%氯化鈉溶液的30G輸液針頭從小鼠角鞏膜緣偏角膜側約1 mm處穿刺至左眼前房，打開輸液開關并將0.9%氯化鈉溶液緩慢升高至術眼上方135 cm處，使眼壓維持在90～100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，虹膜和視網(wǎng)膜變白證實缺血狀態(tài)達成。視網(wǎng)膜缺血過程持續(xù)45 min，隨后取出針頭恢復視網(wǎng)膜血流的再灌注。對照組采用30G針頭插管連接無菌氯化鈉溶液僅作前房穿刺。眼壓由同一操作者持TonoLab眼壓計測量。術后采用妥布霉素軟膏涂于眼表和結膜囊預防眼部感染。剔除術中出現(xiàn)虹膜出血或術后出現(xiàn)醫(yī)源性白內障或眼前節(jié)炎癥的小鼠。

1.2.2動物OCT檢測小鼠視網(wǎng)膜厚度變化 建模后2 d，采用腹腔內注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，托吡卡胺滴眼液點眼擴瞳，奧布卡因滴眼液點眼行表面麻醉；采用動物OCT眼科成像儀Micron Ⅳ掃描小鼠視網(wǎng)膜，移動三維試驗臺使掃描光束經(jīng)角膜垂直透射至眼底，調節(jié)至顯示屏出現(xiàn)清晰的視盤及大血管圖像，視盤位于圖像中心區(qū)域。采用環(huán)形掃描模式采集圖像，收集以視盤為中心的視網(wǎng)膜圓環(huán)圖像，采用Insight軟件(美國Phoenix Research Labs公司)標記視網(wǎng)膜全層，并通過軟件導出厚度差表格計算視網(wǎng)膜全層厚度。

1.2.3免疫熒光染色法觀察視網(wǎng)膜ZO-1蛋白變化 建模后2 d，每組任意選取5只小鼠，頸椎脫臼法處死后摘取左眼眼球制備視網(wǎng)膜冰凍切片，采用體積分數(shù)0.25% Triton X-100室溫下封閉15 min，質量分數(shù)3%牛血清白蛋白室溫下通透60 min。切片樣本加入兔抗小鼠ZO-1(1∶ 150)抗體后于4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌后室溫下用相應二抗(cy5，1∶ 300)孵育1 h，DAPI(1∶ 2 000)染色5 min。熒光顯微鏡下觀察并拍照，高亮的紅色熒光代表陽性染色。

1.2.4胰蛋白酶消化法檢測視網(wǎng)膜毛細血管退化情況 建模后7 d，每組選取5只小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠，摘出眼球，將視網(wǎng)膜視杯在室溫下立即浸入質量分數(shù)10%中性甲醛中固定24 h，去離子水沖洗過夜。將視網(wǎng)膜在包含彈性蛋白酶(40 μg/ml)、PBS(100 mmol/L)、氯化鈉溶液(150 mmol/L)和乙二胺四乙酸的混合液(pH=6.5)中37 ℃孵育2 h。室溫下轉移至Tris-HCl(100 mmol/L，pH=8.5)中孵育1 h。用細毛刷去除視網(wǎng)膜上的非血管組織，并在載玻片上干燥10 min。采用過碘酸希夫染色和蘇木精-伊紅染色視網(wǎng)膜血管。將沿血管長軸未發(fā)現(xiàn)細胞核的血管定義為退化的毛細血管。染色拍照后以視盤為中心劃分區(qū)域，分區(qū)域計數(shù)后相加得到整個視網(wǎng)膜平鋪圖中退化毛細血管數(shù)量。

1.2.5蘇木精-伊紅染色法觀察視網(wǎng)膜炎性細胞浸潤情況 建模后2 d，每組選取5只小鼠，頸椎脫臼法處死小鼠，取出眼球，浸泡于FAS固定液中4 h，蔗糖梯度脫水，OCT包埋，沿視網(wǎng)膜前后徑方向制成8～10 μm厚的冰凍切片。取含視神經(jīng)在內的切片進行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計分析和制圖。計量資料的數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態(tài)分布，以mean±SD表示。2個組退化的毛細血管數(shù)量和視網(wǎng)膜全層厚度差異比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2個組小鼠視網(wǎng)膜厚度及形態(tài)比較

對照組小鼠視網(wǎng)膜顏色均一，視盤呈黃色，視網(wǎng)膜血管以視盤為中心呈放射狀走行；高眼壓組小鼠視網(wǎng)膜可見大片區(qū)域變灰，視網(wǎng)膜水腫程度較重，伴明顯滲出。對照組OCT圖像顯示視網(wǎng)膜各層結構排列均一、整齊；高眼壓組小鼠視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)層結構紊亂，伴明顯滲出，局部神經(jīng)上皮層脫離、隆起。高眼壓組小鼠視網(wǎng)膜全層厚度為(235.8±5.3)μm，較對照組的(213.3±3.9)μm明顯增厚，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.427，P=0.009)(圖1)。

圖1 急性高眼壓誘導視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷后小鼠視網(wǎng)膜全層厚度及形態(tài)變化 A：對照組眼底照相示視網(wǎng)膜血管走行正常 B：對照組OCT圖像示視網(wǎng)膜各層結構排列整齊 C：高眼壓組眼底照相可見大片視網(wǎng)膜水腫 D：高眼壓組OCT圖像示視網(wǎng)膜局部隆起(白色箭頭) E：2個組視網(wǎng)膜全層厚度比較 與對照組比較，aP<0.01(獨立樣本t檢驗，n=5) RNFL：視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層；GCL：神經(jīng)節(jié)細胞層；IPL：內叢狀層；INL：內核層；ONL：外核層Figure 1 Morphology and full thickness of mouse retina after ischemia-reperfusion injury following acute intraocular hypertension A：Normal vessels were observed in fundus image of normal mice B：Different layers of retina were in regular arrangement in OCT image of normal mice C：Retinal edema was seen in fundus image of high-intraocular pressure mice D：Local eminence was observed in the high-intraocular pressure group in OCT image of high-intraocular pressure mice (white arrow) E：Comparison of retinal full thickness between the two groups Compared with the control group，aP<0.01 (Independent-samples t test，n=5) RNFL：retinal nerve fiber layer；GCL：ganglion cell layer；IPL：inner plexiform layer；INL：inner nuclear layer；ONL：outer nuclear layer

2.2 2個組小鼠視網(wǎng)膜組織中ZO-1分布變化

ZO-1免疫熒光染色結果顯示，小鼠RPE層中ZO-1主要定位在細胞膜上，少部分在細胞質中，細胞以六邊形為主。高眼壓組ZO-1出現(xiàn)明顯內化，細胞膜上ZO-1減少，細胞質中ZO-1增多，整體分布紊亂(圖2)。

圖2 急性高眼壓誘導視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷后2 d各組小鼠視網(wǎng)膜組織中ZO-1分布變化(DAPI ×200，標尺=40 μm) 對照組小鼠RPE層中ZO-1主要分布在細胞膜上，高眼壓組ZO-1出現(xiàn)明顯內化，分布紊亂 ZO：緊密連接蛋白；DAPI：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚Figure 2 Distribution of ZO-1 protein in mouse retina at two days after ischemia-reperfusion injury following acute intraocular hypertension by immunofluorescence staining (DAPI ×200，bar=40 μm) ZO-1 in the RPE layer was distributed in the cell membrane in the control group，and was irregular in the high-intraocular pressure group ZO:zonula occludens;DAPI:4′,6-diamidino-2-phenylindole

2.3 2個組小鼠視網(wǎng)膜毛細血管退化比較

建模后7 d，高眼壓組小鼠可見視網(wǎng)膜中退化的毛細血管數(shù)量明顯增多，其血管管徑變窄呈細線狀，對照組小鼠視網(wǎng)膜中退化的毛細血管少。高眼壓組退化的毛細血管數(shù)量為(201.0±13.2)根，明顯多于對照組的(11.2±1.7)根，差異有統(tǒng)計意義(t=14.280，P<0.01)(圖3)。

圖3 急性高眼壓誘導視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷后7 d各組小鼠視網(wǎng)膜毛細血管退化情況 A：對照組小鼠視網(wǎng)膜血管染色可見視網(wǎng)膜中退化毛細血管較少(PAS+HE ×200，標尺=40 μm) B：高眼壓組小鼠視網(wǎng)膜血管染色可見視網(wǎng)膜退化毛細血管數(shù)量明顯增多(紅色箭頭)(PAS+HE ×200，標尺=40 μm) C：2個組小鼠視網(wǎng)膜中退化毛細血管數(shù)量比較 與對照組比較，aP<0.01(獨立樣本t檢驗，n=5)Figure 3 Degeneration of mouse retinal capillaries at seven days after ischemia-reperfusion injury following acute intraocular hypertension A：Staining of retinal blood vessels in the control group (PAS+HE ×200，bar=40 μm) Few degenerated retinal capillaries were observed B：Staining of retinal blood vessels in the high-intraocular pressure group (PAS+HE ×200，bar=40 μm) The number of degenerated retinal capillaries was significantly increased (red arrows) C：Comparison of the number of degraded capillaries in the whole retina between the two groups Compared with the control group，aP<0.01 (Independent-samples t test，n=5)

2.4 2個組小鼠視網(wǎng)膜中炎性細胞浸潤情況比較

蘇木精-伊紅染色結果顯示，高眼壓組小鼠視網(wǎng)膜中可見炎性細胞浸潤，炎性細胞的細胞核為多葉核，主要是嗜中性粒細胞，浸潤的炎性細胞主要位于內界膜下(圖4)。

3 討論

本研究中采用前房灌注升高眼壓的方法建立小鼠缺血-再灌注損傷模型，其是研究青光眼發(fā)病機制及藥物療效的成熟模型[4-6]。研究結果表明，視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷后oBRB遭到破壞，引起炎性細胞浸潤及視網(wǎng)膜水腫、變形，視網(wǎng)膜血管退化。

視網(wǎng)膜特有的BRB包括視網(wǎng)膜毛細血管管壁內皮細胞形成的iBRB以及RPE細胞構成的oBRB，是視網(wǎng)膜免疫赦免的解剖學基礎，為維持正常的視功能提供穩(wěn)定的微環(huán)境[7-8]。BRB遭到破壞可引起外周免疫細胞浸潤、視網(wǎng)膜形態(tài)和功能改變以及神經(jīng)元損傷等病理變化，進而損害視網(wǎng)膜功能。

高眼壓是青光眼發(fā)病機制中關鍵的危險因素，控制眼壓是目前臨床上手術和藥物治療的主要目標。高眼壓引起RGCs凋亡和視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維損傷的作用機制復雜。目前國內外關于視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷對BRB影響的研究主要集中在iBRB的破壞，研究者們從心臟灌注伊文思藍后取視網(wǎng)膜鋪片進行染色觀察，或者計算視網(wǎng)膜中伊文思藍染料增加的質量或熒光強度，以此定性或定量分析視網(wǎng)膜毛細血管的滲漏情況，從而判斷iBRB破壞程度[9-11]，而關于視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷對oBRB作用的報道較少見。oBRB在視網(wǎng)膜中扮演著重要的角色，其將脈絡膜與視網(wǎng)膜分隔[12]。RPE中的ZO-1構成了oBRB，ZO-1對維持oBRB的功能非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)在急性高眼壓誘導的視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷后，分布在小鼠RPE細胞膜上的ZO-1出現(xiàn)內化和紊亂，證明了視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷會破壞RPE間的緊密連接，從而破壞oBRB的完整性。這種急性高眼壓引起視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷導致ZO-1表達的內化和紊亂與光損傷、腫瘤壞死因子α及白細胞介素1β刺激后RPE細胞上ZO-1的表達改變類似[13-14]。

本研究中蘇木精-伊紅染色結果顯示，高眼壓組小鼠視網(wǎng)膜各層中均可見粒細胞浸潤，以分葉核的中性粒細胞為主。這種來自外周血液循環(huán)中的粒細胞在視網(wǎng)膜的出現(xiàn)與oBRB和iBRB的破壞有關，意味著視網(wǎng)膜的免疫赦免狀態(tài)被打破。外周血中的白細胞穿過BRB的具體機制較復雜，研究發(fā)現(xiàn)這種遷移需要白細胞本身的改變、BRB的破壞及視網(wǎng)膜周圍的微環(huán)境發(fā)生改變[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷后7 d視網(wǎng)膜毛細血管出現(xiàn)退行性變，萎縮的毛細血管明顯增多，意味著BRB被破壞后引起的視網(wǎng)膜微環(huán)境改變對視網(wǎng)膜中的毛細血管造成明顯損害。

RPE細胞構成的oBRB將神經(jīng)視網(wǎng)膜與有孔的脈絡膜毛細血管分開，保證生理狀態(tài)下視網(wǎng)膜相對脫水、透明的狀態(tài)。oBRB破壞往往伴隨著視網(wǎng)膜形態(tài)結構的改變，并引起視網(wǎng)膜下液積聚。本研究采用OCT法檢測高眼壓損傷后的視網(wǎng)膜形態(tài)及厚度，相較蘇木精-伊紅染色檢測無創(chuàng)且更準確，避免了在制片和染色過程中可能帶來的誤差，同時可以觀察到小鼠的眼底。本研究中動物OCT檢查結果顯示，高眼壓組小鼠RPE層結構紊亂伴有明顯滲出，神經(jīng)上皮層局部脫離、隆起，眼底照相可見大片區(qū)域變灰，視網(wǎng)膜水腫程度較重。此外，建模后2 d高眼壓組視網(wǎng)膜較對照組有所增厚，這與oBRB遭到破壞后視網(wǎng)膜水腫的現(xiàn)象相符。

綜上所述，本實驗通過建立小鼠急性高眼壓模型引起視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷，結果發(fā)現(xiàn)損傷后oBRB的完整性遭到破壞，引起外周循環(huán)中粒細胞的浸潤及視網(wǎng)膜水腫，甚至脫離，視網(wǎng)膜毛細血管出現(xiàn)萎縮。本研究結果為青光眼發(fā)病機制的研究及治療提供了新的思路，值得進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明李雯：設計實驗，實施研究，采集并分析數(shù)據(jù)，對文稿審閱修改；曹興：實施研究，分析數(shù)據(jù)，起草文稿；葉長華：設計實驗，分析數(shù)據(jù)，對文稿審閱修改，指導實驗進展，提供實驗經(jīng)費