蔣依琳 張曉敏 邵先鋒 安金穎 蘇琳 蔣元豐 李筱榮

天津醫(yī)科大學眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學眼視光學院 天津醫(yī)科大學眼科研究所 天津市視網(wǎng)膜功能與疾病重點實驗室 天津市眼科學與視覺科學國際聯(lián)合研究中心 300384

新生血管性眼病是一類常見的眼部疾病，其發(fā)生與病理條件下眼部血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平升高密切相關，抗VEGF藥物可在一定程度上發(fā)揮治療新生血管性眼病的效果，然而，長期使用抗VEGF藥物存在促進纖維血管膜產(chǎn)生和造成視網(wǎng)膜萎縮等風險[1]。因此，探索具有VEGF抑制作用的新型新生血管治療制劑對于眼部新生血管性疾病的治療具有重要意義。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)最早發(fā)現(xiàn)于人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的條件培養(yǎng)基中，被認為具有神經(jīng)保護特性[2]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)PEDF可通過誘導活化內(nèi)皮細胞凋亡和拮抗VEGF從而發(fā)揮抑制血管生成的作用[3-4]，是天然存在的有效抗新生血管因子。PEDF在血漿中半衰期較短，外源性給藥不易達到理想的治療效果，其臨床轉化受到限制。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)技術的飛速發(fā)展和基因修飾技術的興起為PEDF的臨床應用帶來了希望。MSCs是一類具有自我更新、高度增生、多向分化、歸巢遷移、低免疫原性特點的成體干細胞，具有損傷修復、神經(jīng)保護、免疫抑制、營養(yǎng)、基因工程載體等作用。研究表明，MSCs在炎癥、退行性疾病、免疫性疾病中均可發(fā)揮一定的治療作用[5-7]。在眼科領域，已證實MSCs可用于治療視網(wǎng)膜及視神經(jīng)病變、眼部外傷、干眼等眼部疾病[8-9]。基因修飾技術通過基因組修飾改變細胞遺傳物質(zhì)，改善和增強生物細胞功能[10]。PEDF基因修飾MSCs有望發(fā)揮二者的協(xié)同作用，增強對眼科相關疾病的治療作用。經(jīng)PEDF基因修飾的MSCs作為治療新生血管性疾病和神經(jīng)退行性疾病的新型生物制劑，目前已用于腦、肺臟、肝臟和腸道腫瘤的治療研究[11-14]；在眼科領域，研究發(fā)現(xiàn)PEDF基因修飾MSCs對糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜組織具有保護作用[15]?；蛐揎椩诟淖兗毎康幕虮磉_水平的同時可引起細胞的一系列變化，但目前尚未有研究對此進行深入探討。蛋白質(zhì)組學技術可用于探索細胞內(nèi)蛋白的種類及動態(tài)變化，為基因修飾后MSCs蛋白質(zhì)組學及功能特點的研究提供新思路。本研究擬采用定量蛋白質(zhì)組學技術對慢病毒介導PEDF基因修飾后的人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)中蛋白表達量進行測定，結合基因本體論(Gene Ontology，GO)分析和Reactome信號通路顯著性富集對差異蛋白進行生物信息學分析，為深入了解PEDF基因修飾后hUCMSCs的功能變化提供實驗依據(jù)，為其應用于新生血管性眼病的臨床治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞來源 慢病毒介導PEDF基因修飾的hUCMSCs和正常hUCMSCs由北京貝來生物科技有限公司提供。

1.1.2主要試劑及儀器 磷酸鹽緩沖液(phosphate bufferd saline，PBS)(美國Gibco公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；二硫蘇糖醇(dithiothreotol，DTT)、碘乙酰胺(iodoacetamide，IAA)、尿素、釩酸鈉、氟化鈉、脫氧膽酸鈉(美國Sigma公司)；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(瑞士Roche公司)；胰蛋白酶(美國Progema公司)。96孔板(美國Corning公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；Triple TOF 6600質(zhì)譜儀、ekspert nanoLC 415液相色譜儀(美國AB Sciex公司)。

1.2 方法

1.2.1慢病毒介導的PEDF基因修飾hUCMSCs蛋白質(zhì)譜樣本的制備 以3株不同臍帶來源的正常hUCMSCs為對照組(批號：B00361、B00160、B00055)，以3株慢病毒介導PEDF基因修飾的對照組同源hUCMSCs作為實驗組(批號：PEDF-17015、PEDF-17003-2、PEDF-17003-1)，對照組及實驗組細胞均為P5代。室溫條件下1 000×g離心5 min，使用預冷的PBS清洗細胞3次，加入8 mol/L尿素裂解液，室溫下裂解5 min。將樣本置于冰上進行超聲破碎，超聲能量為35%，超聲3 s，停3 s，超聲時長為2 min。20 ℃條件下14 000×g離心10 min。取上清液，采用BCA法測定樣本蛋白濃度。每個樣本取等量蛋白，加入終濃度為10 mmol/L的DTT 37 ℃孵育1 h，斷開蛋白二硫鍵。加入終濃度為40 mmol/L的IAA室溫條件下避光孵育1 h進行烷基化反應。在集合管上標記樣本編號，采用150 μl甲醇溶液平衡相對分子質(zhì)量10 000超濾管2次，20 ℃下14 000×g離心5 min。加入50 mmol/L的碳酸氫銨(NH4HCO3)平衡液300 μl沖洗2次。每管加入100 μg處理后的樣本，4 ℃條件下14 000×g離心20 min。加入NH4HCO3溶液300 μl，清洗3次，更換收集管，加入NH4HCO3溶液75 μl至超濾管中，加入3 μg胰蛋白酶，37 ℃孵育12～16 h。用移液槍吹打混勻超濾管中的樣本，4 ℃條件下14 000×g離心20 min，加入NH4HCO3溶液50 μl沖洗2次，向收集管中加入體積分數(shù)1%甲酸溶液終止酶切反應，60 ℃真空蒸干后，每管加入0.1%甲酸水溶液30 μl重懸獲得肽段樣本，采用NanoDrop微量分光光度計測定肽段濃度。

1.2.2質(zhì)譜檢測法鑒定細胞中可定量蛋白及其表達 樣本進行高pH反向分餾處理后，取1.5 μg肽段，用含0.1%甲酸、體積分數(shù)2%乙腈的水溶液以3 μl/min流速將其加載至C18預柱上(100 μm×2 cm，C18填料規(guī)格為3 μm、120 A)。使用不同梯度的洗脫劑洗脫預柱，洗脫劑為97.9%乙腈、體積分數(shù)2%水和0.1%甲酸，洗脫肽段經(jīng)分析柱(150 μm×15 cm，C18填料規(guī)格為1.9 μm、120 A)分離并進入質(zhì)譜檢測。洗脫劑梯度為0 min-5%、2 min-10%、65 min-22%、91 min-35%、92 min-80%、105 min-80%、106 min-5%、120 min-5%，流速為500 nl/min。數(shù)據(jù)采集模式為SWATH。質(zhì)譜采集參數(shù)：飛行時間質(zhì)譜(time of flight mass spectrometer，TOF-MS)累加時間為0.05 s，二級采用高靈敏掃描方式，可變窗口數(shù)為100個，每個窗口累加時間為30 ms，質(zhì)量掃描范圍為100～1 500，使用SWATH Variable Window Calculator_V1.1程序計算每個可變窗口的質(zhì)量范圍。

1.2.3質(zhì)譜數(shù)據(jù)的生物信息學分析 對SWATH模式采集的數(shù)據(jù)進行定量，定量時參數(shù)設置：每個蛋白選取6個肽段，每個肽段選取6個離子對，肽段可信度為99%，假陽性率為1%，排除修飾肽段，峰值提取窗口為10 min，質(zhì)量偏差50 ppm以內(nèi)。每10 min選取2個內(nèi)源性肽段進行保留時間矯正，輸出峰面積作為原始定量值。對所獲定量值進行l(wèi)og2轉換，使其分布接近正態(tài)分布。采用R語言preprocessCore包中的normalize.median函數(shù)對log2轉換后的數(shù)據(jù)進行歸一化，去除無基因名字的蛋白，對所獲數(shù)據(jù)進行生物信息學分析。采用R語言corrplot包進行Pearson相關分析，采用火山圖和聚類分析熱圖觀察組間差異蛋白表達情況，采用R語言clusterProfiler包進行GO分析和Reactome信號通路富集，采用String 11.0數(shù)據(jù)庫分析蛋白-蛋白間相互作用，作用強弱以節(jié)點大小和連線粗細表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用R語言stats包t.test函數(shù)進行統(tǒng)計分析，計量資料經(jīng)直方圖檢驗接近正態(tài)分布，采用均衡分組單因素干預兩水平研究設計，實驗組與對照組間蛋白表達差異比較采用獨立樣本t檢驗，差異表達倍數(shù)>1.5且P<0.05的蛋白為差異蛋白。

2 結果

2.1 慢病毒介導的PEDF基因修飾后hUCMSCs蛋白表達變化

質(zhì)譜分析共鑒定出5 361個可定量蛋白。與對照組相比，實驗組慢病毒介導的PEDF基因修飾后差異表達倍數(shù)>1.5且P<0.05的蛋白共432個，其中上調(diào)蛋白219個，包括絲氨酸蛋白酶抑制劑家族F成員1(serpin family F member 1，SERPINF1)、DEAD-box家族螺旋酶59(DEAD-box helicase 59，DDX59)、血小板反應蛋白1(thrombospondin 1，THBS1)等；下調(diào)蛋白213個，包括Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(collagen type Ⅰ alpha 1 chain，COL1A1)、COL18A1等(圖1，2)。Pearson相關分析顯示，實驗組與對照組樣本組內(nèi)及組間蛋白表達量相關系數(shù)均≥0.96，表明數(shù)據(jù)具有極高重復性(圖3)。

圖1 實驗組和對照組差異蛋白聚類熱圖 實驗組為慢病毒介導PEDF基因修飾的hUCMSCs，對照組為正常hUCMSCs。右側為差異蛋白基因，紅色方格代表上調(diào)蛋白，藍色方格代表下調(diào)蛋白 COL1A2：Ⅰ型膠原蛋白α2鏈；IL：白細胞介素；DDX：DEAD-box家族螺旋酶；SERPINF：絲氨酸蛋白酶抑制劑家族F成員 圖2 慢病毒介導的PEDF基因修飾后差異蛋白火山圖 紅點表示上調(diào)蛋白，綠點表示下調(diào)蛋白 COL3A1：Ⅲ型膠原蛋白α1鏈；SERPINF：絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員F；DDX：DEAD-box家族螺旋酶 圖3 實驗組和對照組樣本間差異蛋白表達量Pearson相關分析 C：對照組，為正常hUCMSCs；E：實驗組，為慢病毒介導PEDF基因修飾的hUCMSCsFigure 1 Heat map of differentially expressed proteins between the experimental group and control group Cells in the experimental group were hUCMSCs with PEDF gene modification mediated by lentivirus，and cells in the control group were normal hUCMSCs.On the right were the genes of differentially expressed proteins.Red squares represented up-regulated proteins，and blue squares were down-regulated proteins COL1A2:collagen type Ⅰ alpha 2 chain;IL:interleukin;DDX:DEAD-box helicase;SERPINF:serpin family F member Figure 2 Volcano plots of differentially expressed proteins after PEDF gene modification medicated by lentivirus Red dots indicated up-regulated proteins，and green dots were down-regulated proteins COL3A1:collagen type Ⅲ alpha 1 chain;SERPINF:serpin family F member;DDX:DEAD-box helicase Figure 3 Pearson correlation analysis of samples between the two groups C：Normal group with the normal hUCMSCs；E：Experimental group with PEDF gene-modified hUCMSCs mediated by lentivirus

2.2 慢病毒介導的PEDF基因修飾后差異蛋白GO和Reactome信號通路分析

GO分析結果顯示，與對照組相比，實驗組慢病毒介導的PEDF基因修飾后上調(diào)蛋白參與纖維蛋白溶解、細胞外結構構建、一氧化氮介導的信號轉導調(diào)節(jié)、轉運蛋白活性調(diào)節(jié)等生物學進程，位于細胞-基質(zhì)連接、焦點連接等處，顯著富集的分子功能包括肌動蛋白結合、蛋白質(zhì)-脂質(zhì)復合物結合、脂蛋白顆粒結合、細胞外基質(zhì)結構組成等；下調(diào)蛋白參與的生物學進程包括仲醇及膽固醇生物合成、甾醇生物合成調(diào)控、輔酶代謝、肽酶活性調(diào)節(jié)、細胞-基質(zhì)黏附等，分布于膠原三聚體、膠原蛋白細胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等處，顯著富集的分子功能包括具有抗拉強度的細胞基質(zhì)結構組成、血小板衍生生長因子結合、輔酶結合、氧化還原酶活性調(diào)節(jié)等(圖4)。

圖4 慢病毒介導的PEDF基因修飾后差異蛋白GO分析 縱坐標為基因注釋富集條目；橫坐標為校正后P值，該值越小表示富集越顯著 A：上調(diào)蛋白 B：下調(diào)蛋白Figure 4 GO analysis result of differentially expressed proteins after PEDF gene modification mediated by lentivirus The ordinate showed the enrichment of GO annotation terms，and the abscissa showed the corrected P value.The smaller the P value，the more significant the enrichment A：Up-regulated proteins B：Down-regulated proteins

Reactome信號通路分析結果顯示，實驗組慢病毒介導的PEDF基因修飾后上調(diào)蛋白主要參與胰島素樣生長因子結合蛋白(insulin like growth factor binding protein，IGFBP)調(diào)節(jié)IGF的運輸和攝取及翻譯后蛋白質(zhì)磷酸化等通路，下調(diào)蛋白主要參與細胞外基質(zhì)構成、糖皮質(zhì)激素代謝等通路(圖5)。

圖5 慢病毒介導的PEDF基因修飾后差異蛋白參與的信號通路分析 縱坐標為Reactome信號通路富集條目；橫坐標為參與相應通路的差異蛋白數(shù)目與鑒定出的總蛋白數(shù)比值；點的顏色表示校正后P值，該值越小，表示參與相應信號通路的差異蛋白富集越顯著；點的大小表示參與相應信號通路的差異蛋白數(shù)目，該點越大，表示該通路中差異蛋白數(shù)目越多 A：上調(diào)蛋白 B：下調(diào)蛋白 IGFBP：胰島素樣生長因子結合蛋白；NMDA：N-甲基-D-天冬氨酸；SREBP：固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白；PTK：酪氨酸激酶Figure 5 Reactome pathway analysis result of differentially expressed proteins after PEDF gene modification mediated by lentivirus The ordinate showed the enriched Reactome pathways and the abscissa showed the ratio of the number of proteins in each pathway to the number of differentially expressed proteins.The color of the dot displayed the corrected P value.The smaller the P value，the more significant the enrichment of differential proteins involved in the corresponding signaling pathway.The size of the dot indicated the number of differentially expressed proteins involved in the corresponding signaling pathway.The larger the dot，the greater the number of differential proteins in the pathway A：Up-regulated proteins B：Down-regulated proteins IGFBP：insulin like growth factor binding protein;NMDA：N-methyl-D-aspartic acid；SREBP：sterol regulatory element binding protein；PTK：phosphotyrosinekinase

2.3 慢病毒介導PEDF基因修飾后差異蛋白相互作用

差異蛋白相互作用分析顯示，上調(diào)蛋白中，THBS1、COL13A1、載脂蛋白B等與其他差異蛋白具有較強的相互作用；下調(diào)蛋白中，COL1A1、COL18A1、整合素亞基β5等與其他差異蛋白具有較強相互作用，其中COL1A1與SERPINF1相互作用明顯(圖6)。

圖6 慢病毒介導的PEDF基因修飾后差異蛋白相互作用網(wǎng)絡 差異蛋白及其相互作用以節(jié)點和連線表示，紅點代表上調(diào)蛋白，藍點代表下調(diào)蛋白。點的顏色深度表示差異蛋白變化倍數(shù)，顏色越深表明變化倍數(shù)越大；點的大小表示與該蛋白具有相互作用的蛋白數(shù)；連線表示蛋白間相互作用可信度 COL1A1：Ⅰ型膠原蛋白α1鏈；THBS：血小板反應蛋白Figure 6 Interaction network of differentially expressed proteins after PEDF gene modification mediated by lentivirus Differentially expressed proteins and their interactions were represented by dots and lines.Red dots represented up-regulated proteins，and blue dots exhibited down-regulated proteins.The depth of the dot color indicated the fold change of the differential proteins.The darker the color，the greater the fold change.The size of the dot indicated the number of proteins that had an interaction with the protein.The line indicated the credibility of the interaction between the proteins COL1A1:collagen type Ⅰ alpha 1 chain;THBS:thrombospondin

3 討論

年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變和新生血管性青光眼等眼病均可出現(xiàn)眼部新生血管，嚴重危害患者視力，病變發(fā)生和發(fā)展與眼部VEGF水平密切相關。對VEGF有拮抗作用的PEDF及與PEDF有協(xié)同作用的MSCs近年來受到眼科研究者的高度關注。本研究對慢病毒介導的PEDF基因修飾后hUCMSCs蛋白質(zhì)組學變化進行分析，以期為探索更有效的新生血管性眼病治療方法提供新思路。

MSCs來源廣泛，不同來源的MSCs功能特點有所不同，目前研究中所涉及的MSCs主要來自骨髓、臍帶、脂肪組織和沃頓膠等。MSCs表達多種生物活性分子，可通過旁分泌的方式或細胞外囊泡介導調(diào)節(jié)組織微環(huán)境[16]。近年來，有研究采用蛋白質(zhì)組學技術探索不同類型MSCs及其分泌組的蛋白質(zhì)表達水平，以深入了解MSCs的功能及作用機制。Islam等[17]對多種組織來源MSCs分泌組行蛋白質(zhì)組學分析，結果表明hUCMSCs中血小板衍生生長因子β1、血小板衍生生長因子D和單核細胞趨化蛋白1等參與細胞信號傳遞的蛋白表達水平顯著上調(diào)，而基質(zhì)金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑和補體因子等分解代謝相關蛋白表達水平顯著下調(diào)，深入研究發(fā)現(xiàn)hUCMSCs具有較好的抗炎和營養(yǎng)作用。Qiu等[18]進行的蛋白質(zhì)組學分析表明，MSCs衍生的胞外囊泡中半乳糖凝集素3結合蛋白、穿透素3和腦啡肽酶等蛋白可參與免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護和多個器官疾病的治療。盡管MSCs相關蛋白質(zhì)組學研究較多，但針對基因修飾后MSCs蛋白質(zhì)組學改變的研究尚未見報道。慢病毒屬于逆轉錄病毒，對靶細胞毒性低，具有低免疫原性和較高轉染效率的特點，可作為載體攜帶外源性目的基因轉染至宿主細胞中，通過將外源基因整合至宿主細胞基因上實現(xiàn)目的基因的長時間穩(wěn)定表達。本研究通過觀察慢病毒介導PEDF基因修飾的hUCMSCs蛋白質(zhì)組學變化情況，探索慢病毒介導的PEDF基因修飾對細胞產(chǎn)生的影響。

本研究結果表明，慢病毒介導PEDF基因修飾后的hUCMSCs共有432個蛋白表達水平發(fā)生顯著改變。其中SERPINF1，即PEDF顯著上調(diào)，表明慢病毒介導的基因修飾實現(xiàn)hUCMSCs中PEDF過表達。DEAD-box家族RNA解旋酶參與轉錄、mRNA剪接、翻譯起始、RNA轉運和衰變等過程，在RNA代謝中發(fā)揮至關重要的作用[19]。本研究中，DEAD-box家族RNA解旋酶中的DDX59顯著上調(diào)。研究表明，DDX59參與大腦發(fā)育，編碼該蛋白的基因突變可導致中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受損[20]。目前，尚未有研究將DDX59應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，其是否可與PEDF協(xié)同發(fā)揮眼部神經(jīng)保護作用有待進一步探索。上調(diào)蛋白THBS1在調(diào)節(jié)生理性和病理性血管生成中起關鍵作用，已有研究將其應用于腫瘤治療，結果表明其可通過抑制腫瘤血管形成起到抗腫瘤作用[21]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在化學性角膜灼傷中，移植的MSCs可通過旁分泌THBS1、白細胞介素(interleukin，IL)-10、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-6等可溶性因子發(fā)揮抗炎和抗血管生成的治療作用[22]。THBS1對眼部新生血管性疾病的治療作用及其機制有待進一步研究。此外，研究證實THBS1可通過激活內(nèi)源性TGF-β誘導MSCs增生，是MSCs重要的調(diào)節(jié)因子[23]。本研究結果表明，慢病毒介導PEDF基因修飾hUCMSCs后可引起THBS1表達水平升高，有望增強hUCMSCs抗血管生成和增生能力，協(xié)同PEDF發(fā)揮眼科疾病治療作用。

細胞外基質(zhì)為干細胞提供結構支持，參與干細胞功能調(diào)節(jié)的信號傳導。研究表明，細胞外基質(zhì)是MSCs多種生化和機械信號的儲存庫，這些信號可通過細胞表面受體-蛋白相互作用進行傳導，進而影響細胞信號通路，改變細胞功能[24]。本研究結果顯示，COL1A1與PEDF間相互作用較強，該蛋白與COL1A2、COL3A1和COL5A1等蛋白均為下調(diào)蛋白，參與細胞外基質(zhì)結構組成，表明慢病毒介導PEDF基因修飾后的hUCMSCs中多個參與細胞外基質(zhì)構成的蛋白表達水平發(fā)生顯著改變，細胞功能可能由此受到明顯影響。

研究表明，IGF系統(tǒng)在干細胞生物學中發(fā)揮重要作用，IGF可促進MSCs增生并減少其凋亡，促進MSCs自我更新和發(fā)揮多能性[25]。本研究表明，IGFBP調(diào)節(jié)的IGF運輸和攝取通路明顯上調(diào)，可增強hUCMSCs結合和攝取IGF的能力，從而優(yōu)化自身功能。

綜上所述，本研究結果顯示慢病毒介導PEDF基因修飾的hUCMSCs中DDX59、THBS1表達水平升高，有望與PEDF發(fā)揮協(xié)同作用，應用于眼部新生血管性疾病及神經(jīng)退行性病變的治療。此外，COL1A1等細胞外基質(zhì)構成相關蛋白表達水平的改變及IGFBP調(diào)節(jié)IGF運輸和攝取通路的上調(diào)影響hUCMSCs的信號傳導，優(yōu)化細胞功能，提升其眼科臨床應用價值。未來可依據(jù)本研究分析結果深入探討，尋找慢病毒介導PEDF基因修飾hUCMSCs的治療靶點，進一步探索慢病毒介導PEDF基因修飾的hUCMSCs在眼部新生血管性疾病治療中的作用及機制。本研究為系列研究的一部分，整體研究周期較長，后續(xù)實驗中我們將對質(zhì)譜分析結果進行驗證并對蛋白功能進行探索，進一步探討慢病毒作為獨立因素可能帶來的影響。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

志謝感謝北京貝來生物科技有限公司劉擁軍、劉廣洋提供hUCMSCs細胞樣本，為本研究的順利開展做出重要貢獻