朱恩澤，孫淑萍，吳晨光，李安琪，孫 琪，杜云艷，謝先進(jìn)

及己（Chloranthus serratusRoem.et Schalt.）為金粟蘭科金粟蘭屬植物，通常以根、全草或地上部分入藥.它具有解毒消腫、活血化瘀、祛風(fēng)止痛、抗菌消炎、通筋活絡(luò)的功效，可以治療跌打損傷、癤腫等癥.研究證實(shí)，及己有明顯的抗炎活性［1?2］，但同時具有毒性，服用過量的及己會導(dǎo)致患者手足抽搐、嘔吐、結(jié)膜充血等，甚至出現(xiàn)死亡［3］.尚不清楚及己何種部位在保持良好治療效果的同時毒性較小.前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，及己根、莖、葉醇提取物的心臟毒性作用機(jī)制可能與激活脂質(zhì)過氧化物酶有關(guān)［4］.通過比較及己根和雷公藤誘導(dǎo)的大鼠肺毒性大小發(fā)現(xiàn)，及己水提取物可能通過激發(fā)氧化應(yīng)激并調(diào)控Nrf2/HO?1通路誘導(dǎo)肺毒性［5］.張武等研究表明，因及己中毒死亡的小鼠經(jīng)肉眼觀察肺組織有淤血水腫.光鏡下，肺組織和毛細(xì)血管出現(xiàn)淤血擴(kuò)張、灶性出血及局部肺水腫的癥狀，且部分肺泡腔內(nèi)可見蛋白性液體［6］.以上均表明，及己具有肺毒性，但是其與劑量的相關(guān)性尚無明確的定論.

多項(xiàng)研究均表明及己對多種臟器有毒性［7］，其中，最易受損的是肺組織，因?yàn)樗呛趿孔疃嗟钠鞴伲宰钜资軆?nèi)源性和外源性氧自由基損傷［8］.因此，在肺組織中發(fā)生的氧化損傷可能是大鼠發(fā)生肺損傷的首要原因.未見文獻(xiàn)報(bào)道及己地上部分醇提取物高低劑量致肺毒性是否呈劑量依賴性，且其毒性機(jī)制尚不明確.中草藥的合理利用受到國內(nèi)外多數(shù)學(xué)者和專家關(guān)注，中藥確有良好的治療作用，但其臨床應(yīng)用一直受其毒性限制，成為中藥合理利用的一道難題.因此，當(dāng)開發(fā)和合理利用中藥時，我們必須對其毒性進(jìn)行研究.

目前比較明確的中藥毒性機(jī)制為機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基參與氧化應(yīng)激反應(yīng)從而對機(jī)體產(chǎn)生毒性［9］.在氧自由基產(chǎn)生和消耗達(dá)到平衡時，機(jī)體能夠維持正常的生理狀態(tài)，這種平衡一旦被打破，就會誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷.一般情況下，肺能夠清除體內(nèi)氧自由基，使其產(chǎn)生和清除保持恒定，是因?yàn)榉渭?xì)胞內(nèi)含有許多具有較好的氧自由基清除功效的酶參與氧自由基的清除，并抵抗氧自由基造成的肺組織損傷［10］.和氧化應(yīng)激直接相關(guān)的指標(biāo)為總超氧化物歧化酶（T?SOD）、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物?丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）等.

本實(shí)驗(yàn)初步考察了及己地上部分醇提取物的肺毒性大小，并初步探討了其毒性機(jī)制，為及己安全合理應(yīng)用于臨床提供了參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

及己采收于廣西玉林，經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院朱建華教授參考《中藥大辭典》及中國植物圖譜數(shù)據(jù)庫鑒定為真品，常溫干燥保存.

1.2 動物

Sprague?Dawley（SD）大鼠（清潔級雄性），體重200±10 g，從青龍山動物場獲得，批準(zhǔn)文號：19?014.飼養(yǎng)條件：溫度24～26℃、相對濕度40%～60%、通風(fēng)且每天光照12 h、自由攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn).

1.3 試劑

GSH（批 號：20190615）、CAT（批 號：20190614）、T?SOD（批號：20190613）、MDA（批號：20190616）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：020817170505）、BeyoECL plus化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號：030519190603）均購自Beyotime Biotech?nology；Mouse Anti?β?Actin（批號：66240?1?LS）、Goat Anti?Mouse IgG（批 號：BST12F21C50）、Rabbit Anti Nrf2（批號：16396?1?AP，美國Pro?teintech公司）、Rabbit Anti HO?1（批號：ZP10 39BP39）、Goat Anti?Rabbit IgG（批 號：BST12 L05A54）、免疫組化三步法試劑盒（批號：12H25C）均購自BOSTER Biological Technology Co.Ltd.

1.4 儀器

高速冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀（General Electric Company）；伯樂電泳儀（Bio?Rad）（上海啟步生物科技有限公司）；EPOCH全波長酶標(biāo)儀（深圳山特電子有限公司）；CKX3OLYMpUS顯微鏡（昆山諾普森實(shí)驗(yàn)室用品科技有限公司）；日立U?5100分光光度計(jì)（日本日立有限公司）等.

1.5 方法

1.5.1 提取物的制備

將及己地上部分洗凈、干燥、粉碎至粗粉并稱取適量，用12倍量75%乙醇浸泡0.5 h，回流提取1.5 h；然后依次用10倍、8倍75%乙醇分別回流提取1.0 h，每次抽濾、合并3次濾液，蒸發(fā)濃縮至無醇味且呈粘稠狀，真空干燥，粉碎并過80目篩，得提取物，計(jì)算提取物得率.得率（%）=提取物重量/藥材粗粉重量×100%.

1.5.2 紫外指紋圖譜分析

稱取0.05 g及己地上部分醇提取物，用75%乙醇溶解配制成1 mg·mL?1的樣品溶液.用75%乙醇進(jìn)行空白校正，在以下光譜條件下用紫外分光光度計(jì)掃描樣品：掃描范圍為190～500 nm；掃描速 度為400 nm·min?1；采樣間隔為1.0 nm.

1.5.3 急性毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)開始前，按照文獻(xiàn)中折算表確定劑量［6］，最終確定大鼠日給藥量（及己地上部分醇提取物質(zhì)量，g·kg?1）=成人日服量（3 g）×0.018（換算系數(shù)）×醇提取物得率×倍數(shù)（DC低組：50倍；DC高組：100倍）×5，即得DC低組、DC高組劑量分別為1.58 g·kg?1、3.16 g·kg?1.選取2只大鼠灌胃給予高劑量的2.5倍（7.90 g·kg?1），在48 h內(nèi)觀察大鼠的形態(tài)變化及存活情況等.

1.5.4 動物分組與給藥

取24只雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)均分為：空白組（KB）、DC低組（50倍）、DC高組（100倍），每組8只.將提取物用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制均勻后灌胃給予大鼠對應(yīng)劑量，KB組給予相同量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，14天內(nèi)每日按時灌胃1次，于第15天處死.

1.5.5 大鼠一般狀況的觀察及其臟器指數(shù)的計(jì)算

實(shí)驗(yàn)期間，每日定時監(jiān)測大鼠的飲食、活動，記錄皮毛、色澤等變化情況.每隔2日稱量一次大鼠體重.于第15天，用20%烏拉坦溶液按照5 mL·kg?1的劑量麻醉大鼠后摘除眼球取血，并頸椎脫臼處死后迅速解剖取出大鼠肺.用分析天平稱重，于?80℃保存?zhèn)溆貌⒂?jì)算臟器指數(shù).臟器指數(shù)（%）=臟器重量/體重×100%.

1.5.6 肺組織勻漿中T-SOD、MDA、GSH和CAT含量測定

取出?80℃保存的肺組織，室溫復(fù)溫，剪下適宜大小稱重，置于手動勻漿器中，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下手動勻漿，以12 000 rpm條件低溫離心15 min，收集上清液，分別按照試劑盒說明書來測定T?SOD、MDA、GSH和CAT的含量.

1.5.7 肺組織病理學(xué)觀察

取適量肺組織，用10%甲醛溶液固定，用脫水劑脫水，石蠟包埋，用切片機(jī)切片、于載玻片貼片、脫蠟復(fù)水，用蘇木素?伊紅（HE）染液染色后，置于光學(xué)顯微鏡下查看并評估各組肺組織病理學(xué)改變，并從以下三項(xiàng)進(jìn)行病理學(xué)損傷評分［11］：①肺毛細(xì)血管充血、肺內(nèi)出血；②炎性細(xì)胞在血管壁及肺間隙集聚或浸潤；③肺泡壁增厚.每項(xiàng)有5個評分，其中無損傷為0分，損傷達(dá)觀察視野的25%為1分，損傷達(dá)觀察視野的50%為2分，損傷達(dá)觀察視野的75%為3分，整個視野彌漫性肺損傷為4分.取各項(xiàng)評分之和為總評分.由不了解本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的專業(yè)病理醫(yī)生進(jìn)行肺損傷評分.

1.5.8 免疫組化法檢測ICAM-1的表達(dá)水平

將1.5.7步驟中制作的切片，經(jīng)脫蠟后依次于100%、95%、85%、75%和50%的酒精中復(fù)水、滅活酶、抗原熱修復(fù)、正常血清封閉、清洗、一抗4℃孵育過夜、二抗孵育1 h、滴加SABC、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片等，于顯微鏡下觀察拍照，用Image J統(tǒng)計(jì)得出陽性表達(dá)值并定量分析.

1.5.9 Western blotting檢測Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)情況

取適量肺組織于EP管中，向管中加入裂解液（RIPA和PMSF比例為100∶1）于冰上研磨勻漿，在4℃下，以12 000 rpm條件用離心機(jī)離心20 min，取上清液為樣品，加上樣緩沖液（5×），于沸水中加熱變性.將蛋白用凝膠電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移至NC膜.用5%脫脂牛奶封閉，清洗后繼續(xù)4℃孵育一抗（β?actin、Nrf2、HO?1）過夜，然后孵育二抗1 h，加入現(xiàn)配的ECL顯影液曝光顯影，用Image J得出條帶的灰度值，取對應(yīng)比值（目的蛋白/內(nèi)參灰度值）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

1.5.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 紫外指紋圖譜

從樣品的全波長掃描光譜可以看出，及己地上部分醇提取物的主要吸收范圍為190～350 nm.及己地上部分醇提取物在292 nm、268 nm、266 nm、247 nm、235 nm、232 nm和190 nm處均有吸收峰，在可見光范圍內(nèi)沒有干擾.見圖1.

圖1 及己地上部分醇提取物的紫外指紋圖譜

2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在灌胃劑量高達(dá)7.90 g·kg?1時，未出現(xiàn)大鼠死亡的現(xiàn)象，這表明DC的LD50高于7.90 g·kg?1.因此，最終以1.58 g·kg?1、3.16 g·kg?1評估DC誘發(fā)大鼠肺毒性大小.

2.3 對各組大鼠一般體征的影響

KB組大鼠飲食正常，毛密、有光澤，活動狀態(tài)均正常，反應(yīng)敏捷.DC低組大鼠皮毛無光澤，活動和飲食均略微減少，反應(yīng)遲鈍；DC高組皮毛暗淡無光，有脫落，皮毛質(zhì)感粗糙，飲食明顯減少，出現(xiàn)嗜睡、精神萎靡的狀態(tài).

2.4 對各組大鼠體重變化的影響

給藥期間，KB組大鼠體重正常升高；與KB組相比，DC低組和DC高組體重變化率明顯降低（p<0.05或p<0.01），且DC高組降低程度更明顯，見圖2.

圖2 各組大鼠體重變化率曲線

2.5 對各組大鼠肺形態(tài)的影響

KB組肉眼觀察可見肺表面呈淡粉紅色且十分光滑，觸摸比較后發(fā)現(xiàn)其具有良好的彈性，未見其他異常；DC低組肺表面局部有少量出血點(diǎn)，彈性尚可；DC高組肺表面有多個明顯的出血點(diǎn)，整個臟器呈深紅色，彈性遠(yuǎn)不及KB組，邊緣有明顯鈍化，見圖3.

圖3 各組大鼠肺形態(tài)

2.6 對各組大鼠肺指數(shù)的影響

連續(xù)灌胃給藥14天后，DC低組、DC高組的肺指數(shù)較KB組略微增加，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），見圖4.

圖4 及己不同部位醇提取物對大鼠肺指數(shù)的影響

2.7 對各組大鼠肺勻漿指標(biāo)T-SOD、MDA、GSH和CAT含量的影響

與KB組相比，DC低組四個指標(biāo)含量變化均不顯著（p>0.05）；DC高組CAT水平較KB組顯著性降低（p<0.05）.DC高組與KB組、DC低組相比，MDA水平極顯著性升高（p<0.01），GSH水平和CAT水平顯著性降低（p<0.05），見表1.

表1 對不同組SD大鼠肺勻漿指標(biāo)的影響（±s，n=8）

表1 對不同組SD大鼠肺勻漿指標(biāo)的影響（±s，n=8）

注：與KB組相比，＊表示p<0.05，＊＊表示p<0.01；與DC低組相比，＃表示p<0.05，＃＃表示p<0.01.

組別KB組DC低組DC高組T?SOD/（U·mg?1）98.84±1.34 96.25±1.11 83.33±1.53＊＊＃＃MDA/（nmol·mg?1）1.08±0.06 1.31±0.05 2.04±0.33＊＊＃＃GSH/（μmol·g?1）4.50±1.29 4.21±0.45 2.52±0.24＊＃CAT/（U·mg?1）4.31±0.39 4.08±0.26 3.67±0.18＊

2.8 對各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響

KB組肺泡組織結(jié)構(gòu)完整，大小正常，未見炎細(xì)胞浸潤，肺泡腔未見擴(kuò)大異常，間質(zhì)無明顯水腫，未見明顯充血情況；DC低組在支氣管周圍有炎細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)不規(guī)則，間質(zhì)有出血現(xiàn)象，血管周圍出現(xiàn)脂肪變態(tài)反應(yīng)；DC高組支氣管四周有明顯炎細(xì)胞浸潤，管壁纖維排列紊亂呈鋸齒狀增生，血管壁出現(xiàn)纖維淀粉樣變性，肺泡結(jié)構(gòu)不規(guī)則，肺泡腔明顯縮小，肺泡壁增厚，有出血現(xiàn)象.DC高組較DC低組病理評分顯著升高（p<0.01），見圖5.

圖5 各組大鼠肺組織HE染色（×200）和病理學(xué)評分

2.9 對各組大鼠肺組織中ICAM-1陽性表達(dá)水平的影響

當(dāng)機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)炎性癥狀時，ICAM?1以在細(xì)胞膜及細(xì)胞漿表達(dá)為主，鏡下觀察呈棕黃色顆粒.與KB組相比，DC高組、DC低組ICAM?1陽性表達(dá)極顯著性增多（p<0.01）.與DC低組相比，DC高組ICAM?1陽性表達(dá)也極顯著性增加（p<0.01）.見圖6.

圖6 各組大鼠肺組織ICAM-1陽性表達(dá)（×200）及表達(dá)率

2.10 對各組大鼠肺組織中Nrf2/HO-1蛋白表達(dá)的影響

與KB組相比，DC低組HO?1蛋白表達(dá)量顯著性下降（p<0.05），Nrf2蛋白表達(dá)極顯著性下降（p<0.01），DC高組Nrf2和HO?1蛋白表達(dá)量均極顯著性下降（p<0.01）.與DC低組相比，DC高組Nrf2和HO?1蛋白表達(dá)量極顯著性下降（p<0.01），見圖7.

圖7 各組大鼠肺組織中HO-1/Nrf2表達(dá)

3 討論與結(jié)論

MDA可導(dǎo)致細(xì)胞異常壞死，具有細(xì)胞毒性［12］，能反應(yīng)細(xì)胞對自由基的清除程度與細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷的程度［13］.GSH是機(jī)體抗氧化劑和細(xì)胞保護(hù)劑，可清除自由基的同時抗脂質(zhì)過氧化損傷［14］.SOD可轉(zhuǎn)化超氧自由基為過氧化物，過氧化物進(jìn)一步被CAT分解，形成抗氧化防御系統(tǒng)，起到減輕損傷的作用［15］.當(dāng)SOD含量降低時，細(xì)胞清除自由基能力減弱，此時細(xì)胞處于過氧化損傷狀態(tài)［16］.CAT和SOD為機(jī)體內(nèi)的保護(hù)酶，其含量變化常被用作判斷損傷程度的指標(biāo)［17］.本實(shí)驗(yàn)中，及己地上部分醇提取物能使肺勻漿中SOD、GSH和CAT含量明顯下降，MDA含量明顯上升，且DC高組比DC低組變化程度更大.可初步判斷及己地上部分醇提取物引起的肺毒性與氧化應(yīng)激有關(guān)，且DC高組影響的水平要高于DC低組，這可能和劑量有一定的相關(guān)性.

ICAM?1可輔助機(jī)體進(jìn)行免疫防御調(diào)整，促進(jìn)炎癥部位的黏連，使白細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，增強(qiáng)炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用.在肺組織有炎性癥狀時，其含量明顯增加，是肺組織細(xì)胞是否受損的判斷指標(biāo)之一［18］.本實(shí)驗(yàn)中，及己地上部分醇提取物能上調(diào)ICAM?1的陽性表達(dá)，且DC高組上調(diào)ICAM?1的表達(dá)比DC低組更明顯，說明DC高組的肺毒性要高于DC低組.

Nrf2/HO?1參與機(jī)體抗氧化的調(diào)整，在生理?xiàng)l件下，Nrf2以結(jié)合物形式存在，沒有活性；但受到氧化應(yīng)激刺激，Nrf2解離且核轉(zhuǎn)位增多，啟動多種抗氧化基因的表達(dá)，增強(qiáng)抗氧化作用，并減輕自由基所導(dǎo)致的臟器損傷［19］.HO?1具有抗氧化、消炎、抑制細(xì)胞凋亡等作用，在機(jī)體受到有害刺激時起到保護(hù)細(xì)胞免受損傷的作用［20］.當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激等刺激時會增強(qiáng)HO?1蛋白表達(dá)水平來保護(hù)自身，但長時間受有毒物質(zhì)刺激時，機(jī)體內(nèi)HO?1表達(dá)水平會降低［21］.本實(shí)驗(yàn)中，與KB組相比，DC高組、DC低組Nrf2、HO?1蛋白表達(dá)量明顯下降，且DC高組下降更明顯，表明及己DC高組、DC低組均給大鼠肺組織造成一定程度的氧化應(yīng)激損傷，其中DC高組肺毒性尤為突出.

以上研究結(jié)果表明，及己地上部分醇提取物呈劑量依賴性地激發(fā)氧化應(yīng)激，調(diào)控Nrf2/HO?1信號通路，導(dǎo)致肺組織損傷，表現(xiàn)為肺組織中的ICAM?1陽性表達(dá)升高.目前對及己根、莖、葉的醇提取物已進(jìn)行體內(nèi)抗炎作用及其對大鼠心、肝、肺、腎毒性的比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中及己根的醇提取物毒性最小且抗炎效果最好［2，4］.

綜上可知，及己的地上部分不是較好的用藥部位，及己根才是較好的用藥部位，可以作為進(jìn)一步開發(fā)研究的目標(biāo)，有望從中提取出單體抗炎成分，為及己的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù).