溫彥靜，彭青△，王靜娜，李曼，常美英

子癇前期（preeclampsia，PE）為一種妊娠期特發(fā)性疾病，是造成孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一［1］。滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲能力下降引起子宮螺旋動脈重鑄障礙是PE 發(fā)病的原因之一［2］?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類鋅依賴性蛋白酶，為血管和子宮重塑的重要調(diào)節(jié)劑，血管MMP2的減少可能導(dǎo)致血管舒張減弱，收縮增強，引起妊娠高血壓和PE［3］。微小RNA（miRNA）的異常表達(dá)與人類多種疾病的發(fā)生有關(guān)，人類胎盤組織中miRNA的異常表達(dá)可能導(dǎo)致胎盤功能障礙或PE等疾?。?］。miR-34a 能夠調(diào)控多種基因的表達(dá)，與多種癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移有關(guān)［5-7］，是公認(rèn)的抑癌基因。Xue等［8］研究表明，PE患者血清miR-34a-5p表達(dá)水平顯著高于健康孕婦。miR-34a 能夠通過靶向MMP2 抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN229 及U251 的遷移和侵襲［9］。人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo來源于早孕期滋養(yǎng)層細(xì)胞，常被用于滋養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)活性研究。本研究通過腫瘤壞死因子（TNF）-α刺激人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo，體外模擬PE的炎性環(huán)境，探討miR-34a能否通過與MMP2結(jié)合，影響滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移，從而參與PE的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo（CN-10079）購自上海弘順生物科技有限公司。TNF-α（SRP3177）購自美國Sigma公司；胎牛血清（G20228）、DMEM培養(yǎng)基（G17115）、胰蛋白酶（G10231）均購自美國Gibco 公司；Lipofectamine 3000 試劑盒（L3000-050）購自美國 Invitrogen 公司；RNAiso Plus試劑盒（RK-0057）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RK-0311）、熒光定量PCR試劑盒（RA-1075）購自日本TAKARA公司；CCK-8細(xì)胞計數(shù)試劑盒（P5119）、蛋白提取試劑盒（SF60013）、BCA 蛋白定量試劑盒（SK10078）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（A0208）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（YT128）購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗人MMP2單克隆抗體（40994）、兔抗人β-actin單克隆抗體（4970）購自美國 Cell Signaling Technology 公司；miR-34a、MMP2、U6、GAPDH 引物以及miR-34a mimics、miR-34a mimics陰性對照、miR-34a inhibitor、miR-34a inhibitor陰性對照由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；MCO-5AC 型CO2培養(yǎng)箱購自日本三洋公司；AE2000型倒置顯微鏡購自北京汗盟紫星儀器儀表有限公司；QuantStudio 3型實時熒光定量PCR（qPCR）儀購自美國ABI 公司；ELx808 型酶標(biāo)儀購自深圳市瑞士寶特貿(mào)易有限公司；ZF-388 型蛋白凝膠成像儀購自上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 對人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo 進(jìn)行常規(guī)復(fù)蘇，轉(zhuǎn)移至含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞生長良好且達(dá)到對數(shù)期時進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.1 TNF-α 刺激人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo 取對數(shù)期的HTR-8/SVneo 細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，接種細(xì)胞至6孔板中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×105個/孔，加入不含胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，分別設(shè)置TNF-α誘導(dǎo)組（將培養(yǎng)液換為含0.5 μg/L TNF-α的DMEM完全培養(yǎng)基）和對照組（僅更換正常新鮮培養(yǎng)液）［10］。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取1.2.1中TNF-α刺激的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo 接種至6孔板中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為6×105個/孔。細(xì)胞融合度達(dá)到60%時，棄去6孔板中培養(yǎng)基，加入含0.5 μg/L TNF-α的新鮮培養(yǎng)基，利用Lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。將細(xì)胞分為對照組（細(xì)胞不做任何處理，正常培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)）、miR-34a mimics組（轉(zhuǎn)染miR-34a mimics）、NC 組（轉(zhuǎn)染miR-34a mimics 陰性對照）、miR-34a inhibitor 組（轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor）、iNC 組（轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor陰性對照）和TNF-α誘導(dǎo)組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染48 h后，倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。

1.2.3 qPCR 檢測各組細(xì)胞 miR-34a、MMP2 mRNA 的表達(dá)水平 按照RNAiso Plus試劑盒說明書提取1.2.2中各組細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。miR-34a 以 U6 作為內(nèi)參基因，MMP2 以 GAPDH 作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計算各組細(xì)胞中miR-34a、MMP2 mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequences表1 引物序列

1.2.4 CCK-8 法檢測各組細(xì)胞增殖情況 取1.2.2 中各組對數(shù)期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/mL，每孔 100 μL 加至 96 孔板中，每組設(shè)置 6 個復(fù)孔，于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃避光培養(yǎng)2 h，棄上清，酶標(biāo)儀450 nm 波長處檢測每孔光密度（OD）值，細(xì)胞增殖抑制率=［（對照組OD 值-實驗組OD 值）/對照組OD值］×100%。

1.2.5 Transwell 侵襲實驗檢測各組細(xì)胞侵襲能力 取1.2.2中各組對數(shù)期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/mL。吸取 100 μL 細(xì)胞懸液加至鋪有 Matrigel 膠的Transwell小室上室，Transwell下室加入600 μL含胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)24 h，倒掉上室培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦去Matrigel膠及未遷移細(xì)胞，無水甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，顯微鏡下隨機讀取5個視野對染色細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，計算平均值。

1.2.6 劃痕實驗檢測各組細(xì)胞遷移能力 取1.2.2 中各組對數(shù)期細(xì)胞接種至6孔板中，37 ℃、5%CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長滿視野時進(jìn)行后續(xù)實驗。黑色馬克筆于6 孔板板后劃線，利用滅菌的20 μL 槍頭在孔板上垂直于劃線進(jìn)行劃痕，劃好后沖洗殘余懸浮液。孔內(nèi)加入不含胎牛血清的DEME 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于0、24 h 后顯微鏡下取點，觀察并拍照。以0 h 時初始距離（D0h）為對比，測量24 h 時距離（D24h），計算細(xì)胞遷移率。遷移率（%）=（D0h-D24h）/D0h×100%。

1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測MMP2 蛋白表達(dá)水平 取1.2.2中各組細(xì)胞，調(diào)整密度為5×105個/mL，每孔100 μL加至96孔板中，培養(yǎng) 24 h 后，棄上清，PBS 洗滌 2 次，重懸細(xì)胞，利用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測定提取總蛋白濃度，蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉遮光封閉2 h。分別加入兔抗人MMP2、β-actin 一抗稀釋液（均為1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜3次，蛋白凝膠成像儀分析MMP2蛋白表達(dá)水平。

1.2.8 雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析 通過Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）數(shù)據(jù)庫預(yù)測人MMP2 基因3′UTR含有與miR-34a的結(jié)合位點。對含結(jié)合位點的MMP2區(qū)段進(jìn)行擴增，并插入到pcDNA 載體上，構(gòu)建pcDNAMMP2-3′UTR-WT 質(zhì)粒；以此質(zhì)粒對結(jié)合片段進(jìn)行定點（Del：55539387-55539393）突 變 ，構(gòu) 建 pcDNA-MMP2-3′UTR-Del 質(zhì)粒。pcDNA-MMP2-3′UTR-WT 質(zhì)粒、pcDNAMMP2-3′UTR-Del 質(zhì)粒分別與miR-34a NC、miR-34a mimics共轉(zhuǎn)染到人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo 中，每組設(shè)置3個重復(fù)，轉(zhuǎn)染6 h 后，更換培養(yǎng)基。質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48 h 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌細(xì)胞；每孔加入50 μL 1×PLB 裂解緩沖液，震蕩，使細(xì)胞全部裂解；在不透光96孔酶標(biāo)板中每孔加上述上清液10 μL，加入100 μL 雙熒光素酶反應(yīng)試劑Ⅱ，檢測螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強度，測定結(jié)束后加100 μL Stop&Glo，檢測內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強度。熒光素酶相對活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞miR-34a及MMP2 mRNA的表達(dá) 與對照組比較，TNF-α誘導(dǎo)組細(xì)胞miR-34a表達(dá)升高，MMP2 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）；與TNF-α 誘導(dǎo)組和NC組比較，miR-34a mimics 組細(xì)胞miR-34a表達(dá)升高，MMP2 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）；與TNF-α誘導(dǎo)組和iNC組比較，miR-34a inhibitor組細(xì)胞miR-34a表達(dá)降低，MMP2 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。見表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of miR-34a and MMP2 mRNA between the six groups表2 各組細(xì)胞miR-34a及MMP2 mRNA表達(dá)水平比較（n=3，）

Tab.2 Comparison of expression levels of miR-34a and MMP2 mRNA between the six groups表2 各組細(xì)胞miR-34a及MMP2 mRNA表達(dá)水平比較（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與TNF-α 誘導(dǎo)組比較，c與NC 組比較，d與iNC組比較，P＜0.05

組別對照組TNF-α誘導(dǎo)組NC組miR-34a mimics組iNC組miR-34a inhibitor組F miR-34a 1.01±0.03 1.58±0.06a 1.55±0.05 3.93±0.04bc 1.52±0.03 0.44±0.04bd 2 290.913＊＊MMP2 mRNA 0.99±0.03 0.54±0.05a 0.53±0.07 0.32±0.04bc 0.55±0.06 0.87±0.05bd 67.943＊＊

2.2 miR-34a 對TNF-α 刺激下人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo 增殖的影響 對照組、TNF-α 誘導(dǎo)組、NC 組、miR-34a mimics 組、iNC 組、miR-34a inhibitor 組 細(xì) 胞 增 殖 抑 制 率 分 別 為 0、（54.37±2.06）% 、（52.75±2.19）% 、（78.93±2.67）% 、（55.29±1.86）% 和（19.16±2.18）%（n=6，F(xiàn)=1 208.115，P＜0.01）。與對照組比較，TNF-α誘導(dǎo)組細(xì)胞增殖抑制率升高（P＜0.05）；與TNF-α 誘導(dǎo)組和NC 組比較，miR-34a mimics 組細(xì)胞增殖抑制率升高（P＜0.05）；與TNF-α誘導(dǎo)組和iNC組比較，miR-34a inhibitor組細(xì)胞增殖抑制率降低（P＜0.05）。

2.3 miR-34a 對TNF-α 刺激下人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo 侵襲和遷移的影響 與對照組比較，TNF-α誘導(dǎo)組細(xì)胞侵襲數(shù)目和遷移率降低（P＜0.05）；與 TNF-α 誘導(dǎo)組和 NC 組比較，miR-34a mimics組細(xì)胞侵襲數(shù)目和遷移率降低（P＜0.05）；與TNF-α誘導(dǎo)組和iNC組比較，miR-34a inhibitor 組細(xì)胞侵襲數(shù)目和遷移率升高（P＜0.05），見表3，圖1、2。

Tab.3 Comparison of cell invasion number and migration rate between the six groups表3 各組細(xì)胞侵襲數(shù)目和遷移率的比較 （n=3，）

Tab.3 Comparison of cell invasion number and migration rate between the six groups表3 各組細(xì)胞侵襲數(shù)目和遷移率的比較 （n=3，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與TNF-α 誘導(dǎo)組比較，c與NC 組比較，d與iNC組比較，P＜0.05

遷移率（%）26.73±2.51 15.46±3.24a 14.59±3.16 6.25±2.18bc 14.34±2.29 23.48±3.57bd 19.413＊＊組別對照組TNF-α誘導(dǎo)組NC組miR-34a mimics組iNC組miR-34a inhibitor組F細(xì)胞侵襲數(shù)目（個）248.32±12.37 123.37±11.26a 126.58±12.35 84.61±11.54bc 117.38±13.65 178.45±14.22bd 64.118＊＊

Fig.1 Effects of miR-34a on cell invasion(crystal violet dyeing,×400)圖1 miR-34a對細(xì)胞侵襲的影響（結(jié)晶紫染色，×400）

2.4 miR-34a 對TNF-α 刺激下人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo 中MMP2 蛋白表達(dá)的影響 對照組、TNF-α 誘導(dǎo)組、NC 組、miR-34a mimics 組、iNC組、miR-34a inhibitor 組MMP2 蛋白表達(dá)分別為1.29±0.13、0.83±0.11、0.85±0.13、0.44±0.14、0.81±0.09、1.16±0.15（n=3，F(xiàn)=16.587，P＜0.01）；與對照組比較，TNF-α 誘導(dǎo)組細(xì)胞MMP2 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與TNF-α 誘導(dǎo)組和NC 組比較，miR-34a mimics 組細(xì)胞MMP2 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與TNF-α誘導(dǎo)組和iNC組比較，miR-34a inhibitor組細(xì)胞MMP2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖3。

Fig.3 Effects of miR-34a on MMP2 protein expression in each group圖3 miR-34a對各組細(xì)胞中MMP2蛋白表達(dá)的影響

2.5 miR-34a 對MMP2 基因的靶向調(diào)節(jié) Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果表明，MMP2 基因 3′UTR 區(qū)含有與miR-34a 結(jié)合位點，位于miR-34a 3′UTR 55539387-55539393 區(qū) 域 ，見 圖 4。 miR-34a NC-pcDNAMMP2-3′UTR-WT 組 、miR-34a mimics-pcDNAMMP2-3′UTR-WT 組、miR-34a NC-pcDNA-MMP2-3′UTR-Del 組 、miR-34a mimics-pcDNA-MMP2-3′UTR-Del 組熒光素酶相對活性分別為2.35±0.02、1.19±0.02、2.32±0.04、2.29±0.05（n=3，F(xiàn)=745.474，P＜0.01）；與 miR-34a NC-pcDNA-MMP2-3′UTRWT 組 比 較 ，miR-34a mimics-pcDNA-MMP2-3′UTR-WT 組熒光素酶相對活性顯著降低（P＜0.05）。

Fig.4 Starbase database predicted that miR-34a had binding sites with MMP2圖4 Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-34a與MMP2具有結(jié)合位點

3 討論

PE是圍產(chǎn)期導(dǎo)致母嬰死亡的主要疾病之一［11］，終止妊娠是唯一有效的治療方法。目前PE 的發(fā)病機制尚不清楚，子宮螺旋動脈重鑄障礙和滋養(yǎng)層細(xì)胞分化缺陷被認(rèn)為是引起PE 的關(guān)鍵因素［12］。滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移能力下降是引起螺旋動脈血管重鑄障礙的主要原因。因此，研究與滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和遷移有關(guān)的因素，可能有助于進(jìn)一步解析PE的發(fā)生機制。高水平TNF-α與妊娠高血壓及PE、妊娠糖尿病等多種妊娠疾病有關(guān)［13］。體外實驗表明，TNF-α刺激人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo后能夠抑制其遷移和侵襲［14］。本研究利用TNF-α 刺激人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo 體外模擬炎癥環(huán)境，發(fā)現(xiàn)TNF-α 刺激人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞后miR-34a表達(dá)水平、細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于對照組，MMP2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞遷移率和侵襲數(shù)目均顯著低于對照組，說明miR-34a、MMP2 可能與細(xì)胞的侵襲和遷移有關(guān)。

miR-34a 是一個公認(rèn)的抑癌基因。研究表明miR-34a過表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、膀胱癌細(xì)胞HT-1197、HT-1376的增殖、侵襲和遷移［5，15］。滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜的穿透性與侵襲性腫瘤相似，Liu 等［16］研究表明 PE 患者胎盤組織和細(xì)胞中miR-34a 表達(dá)水平顯著高于健康孕婦，且miR-34a通過Notch信號通路抑制PE患者胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲。本研究結(jié)果表明，miR-34a 顯著抑制TNF-α刺激導(dǎo)致的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移，而抑制miR-34a表達(dá)，則情況相反，說明miR-34a過表達(dá)可抑制胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移。

滋養(yǎng)層細(xì)胞是胎盤組織的重要細(xì)胞，其能夠通過侵襲和遷移穿透母胎界面，促使胎盤形成，維持正常胎盤功能，胎盤重塑和滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲螺旋動脈可為胎兒提供充足的血液和營養(yǎng)［17-18］。MMP2 在侵襲性絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞中大量表達(dá)，與滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲性高度相關(guān)，能夠在妊娠期間發(fā)揮子宮內(nèi)膜組織重塑的作用［3］。Jin等［19］研究表明抑制MMP2表達(dá)能夠抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo的侵襲和遷移，參與PE 的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，與TNF-α 誘導(dǎo)組比較，miR-34a 過表達(dá)能夠降低細(xì)胞中MMP2 mRNA 及蛋白的表達(dá)，而抑制miR-34a 的表達(dá)能夠增加MMP2 mRNA及蛋白的表達(dá)。生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果表明MMP2的3′UTR序列含有與miR-34a結(jié)合的位點，說明miR-34a與MMP2之間可能存在靶向關(guān)系。Yang 等［20］研究表明 miR-34a 通過靶向抑制MMP2的表達(dá)抑制食管癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究雙熒光素酶實驗進(jìn)一步證明miR-34a mimics-pcDNA-MMP2-3′UTR-WT 組熒光素酶相對活性顯著低于miR-34a NC-pcDNA-MMP2-3′UTRWT 組，提示 miR-34a 抑制 MMP2 的表達(dá)。miR-34a可能通過靶向抑制MMP2 的表達(dá)，降低滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲性，導(dǎo)致子宮螺旋動脈重鑄障礙，進(jìn)而參與妊娠高血壓及PE等疾病的發(fā)生。

綜上所述，miR-34a 可能通過靶向抑制MMP2的表達(dá)抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo的侵襲和遷移，進(jìn)而導(dǎo)致PE的發(fā)生。本研究僅從體外細(xì)胞模擬實驗分析了miR-34a 及MMP2 對PE 的影響，還需結(jié)合臨床研究進(jìn)一步證明miR-34a 靶向調(diào)節(jié)MMP2在PE發(fā)病中的機制。