王會(huì)含，王永堂，苗建華，李鳳新

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450007)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)多發(fā)于老年人，臨床主要病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨退變和關(guān)節(jié)邊緣骨質(zhì)增生[1-2]。隨著人們預(yù)期壽命的延長(zhǎng)，OA的發(fā)病率逐年上升，而其發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞凋亡在OA的發(fā)生過(guò)程中起重要作用，阻止或減緩軟骨細(xì)胞凋亡是防治OA的關(guān)鍵[3-4]。近年來(lái)，臨床多采用以活血和補(bǔ)肝益腎為主的中藥防治OA，川芎是常用藥物之一[5-6]。川芎嗪是從川芎中分離的一種生物堿，朱海泉等[7]研究表明其能夠有效預(yù)防OA。為了探索川芎嗪對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制，我們開(kāi)展了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料膝關(guān)節(jié)軟骨組織來(lái)自在鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院接受膝關(guān)節(jié)置換的患者。試驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司，Ⅱ型膠原酶、多聚甲醛溶液、二甲亞砜(美國(guó)Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)，10%的胎牛血清、苯基甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)購(gòu)自北京孚博生物科技有限公司，甲苯胺藍(lán)(北京索萊寶科技有限公司)，鼠抗人Ⅱ型膠原蛋白一抗(美國(guó)Santa Cruz公司)，生物素標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G二抗(美國(guó)Biotium公司)，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，川芎嗪(純度≥98%，成都德思特生物技術(shù)有限公司)，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FIIC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染色試劑盒、Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，MTT分析試劑盒(美國(guó)Thermo公司)，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ染料法熒光定量試劑盒(日本Takara公司)，擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(北京百奧萊博科技有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量分析試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，兔抗人硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)-2、凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(apoptosis signal regulating kinase，ASK)-1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease，Caspase)-3、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、電化學(xué)發(fā)光(electrogenerated chemiluminescence，ECL)試劑盒(美國(guó)Abcam公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器TD-4M臺(tái)式低速離心機(jī)(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(上海喆圖科學(xué)儀器有限公司)，AE31 EF-INV型熒光顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠(chǎng))，DG5031酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)，Amnis流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD公司)，ABI7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，E-Gel Imager凝膠成像儀(美國(guó)Invitrogen公司)。

2 方 法

2.1 軟骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法將一定量的軟骨組織，使用HBSS沖洗干凈，剪碎后移入直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，加入10 mL含0.2%Ⅱ型膠原酶的DMEM培養(yǎng)基，于CO2濃度5%、溫度37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中。消化4～6 h后，將含有軟骨組織塊的液體移入15 mL離心管，以1200 r·min-1(離心半徑8 cm)離心5 min。棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基?；靹蚝?，接種于25 cm2貼壁式細(xì)胞培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶置于CO2濃度5%、溫度37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h更換1次培養(yǎng)基，待約90%細(xì)胞貼壁時(shí)進(jìn)行傳代。按照1∶2的比例進(jìn)行傳代，每隔3 d傳代1次。于顯微鏡下觀察原代細(xì)胞及第3代細(xì)胞形態(tài)。

2.2 軟骨細(xì)胞鑒定方法取生長(zhǎng)良好的第3代軟骨細(xì)胞，接種于預(yù)先放置爬片的6孔板上，每孔加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。待約70%細(xì)胞貼壁時(shí)，取出細(xì)胞爬片，用PBS洗滌3次，加入 1 mL 濃度為40 g·L-1的多聚甲醛溶液，置于4 ℃冰箱過(guò)夜固定。取出爬片，分別進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色和免疫組化染色，免疫組化染色一抗為鼠抗人Ⅱ型膠原蛋白抗體，使用比例為1∶100，二抗為生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG，使用比例為1∶1000。染色后分別于顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 OA軟骨細(xì)胞模型建立與川芎嗪干預(yù)方法取生長(zhǎng)良好的第3代軟骨細(xì)胞，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)·mL-1。將軟骨細(xì)胞分別接種至4塊6孔板中，每塊板接種5個(gè)復(fù)孔，每個(gè)復(fù)孔接種1 mL。每孔加入1 mL濃度為100 ng·mL-1的TNF-α，于CO2濃度5%、溫度 37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h以建立OA軟骨細(xì)胞模型[8]。培養(yǎng)結(jié)束后，將4塊6孔板隨機(jī)分為對(duì)照組和川芎嗪低、中、高濃度組。用吸管小心棄去培養(yǎng)基，對(duì)照組加入1 mL正常的DMEM培養(yǎng)基，川芎嗪低、中、高濃度組分別加入1 mL含川芎嗪濃度為25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1的DMEM培養(yǎng)基，于CO2濃度5%、溫度37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.4 軟骨細(xì)胞凋亡率測(cè)定方法按照2.3的方法進(jìn)行OA軟骨細(xì)胞模型建立與川芎嗪干預(yù)，取干預(yù)后的軟骨細(xì)胞懸液，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)·mL-1。取100 μL細(xì)胞懸液加入流式管中，再加入5 μL Annexin V-FIIC溶液、5 μL PI溶液及0.5 mL上樣緩沖液，混勻后避光放置15 min，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定軟骨細(xì)胞凋亡率。

2.5 軟骨細(xì)胞活力測(cè)定方法按照2.3的方法進(jìn)行OA軟骨細(xì)胞模型建立與川芎嗪干預(yù)，干預(yù)結(jié)束后，在每孔中加入濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用吸管小心棄去培養(yǎng)基，每孔加150 μL二甲亞砜，振蕩至結(jié)晶物完全溶解。采用DG5031酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度，測(cè)定波長(zhǎng)490 nm。

2.6 軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)分析方法按照2.3的方法進(jìn)行OA軟骨細(xì)胞模型建立與川芎嗪干預(yù)，采用Trizol法提取干預(yù)后軟骨細(xì)胞的總RNA，參照Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ染料法熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，Trx-2、ASK-1、Caspase-3及β-actin基因擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1，反應(yīng)體系參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性35 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸35 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算Trx-2、ASK-1及Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

2.7 軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)分析方法按照2.3的方法進(jìn)行OA軟骨細(xì)胞模型建立與川芎嗪干預(yù)，將干預(yù)后各組軟骨細(xì)胞以無(wú)菌PBS清洗2次；加入適量的含PMSF(濃度為1 mmol·L-1)的RIPA裂解液后，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的EP管中，于冰上裂解20 min；于4 ℃下以12000 r·min-1(離心半徑10 cm)離心10 min，取上清。采用BCA蛋白定量分析試劑盒測(cè)定上清蛋白濃度，調(diào)整樣品蛋白濃度使蛋白上樣量一致，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，采用蛋白印跡法檢測(cè)Trx-2、ASK-1、Caspase-3及β-actin的蛋白表達(dá)量，加入兔抗人Trx-2、ASK-1、Caspase-3一抗(1∶1000)和β-actin一抗(1∶800)，于4 ℃過(guò)夜孵育；洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶3000)。采用ECL試劑盒顯色，于E-Gel Imager凝膠成像儀中顯影并拍攝照片。采用Image J圖像處理軟件處理圖片，提取蛋白條帶的灰度值，分別以β-actin為參照，計(jì)算蛋白條帶的相對(duì)灰度值，分析蛋白表達(dá)水平。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。4組軟骨細(xì)胞凋亡率、活力吸光度值及 Trx-2、ASK-1、Caspase-3的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的組間比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果原代細(xì)胞培養(yǎng)至第15天，可見(jiàn)組織塊周?chē)屑?xì)胞成簇生長(zhǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)顯示細(xì)胞呈梭形、三角形或多角形[圖1(1)]；顯微鏡下觀察第3代軟骨細(xì)胞形態(tài)顯示，細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形[圖1(2)]。

圖1 軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果(×100)

3.2 軟骨細(xì)胞鑒定結(jié)果甲苯胺藍(lán)染色顯示，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，有1～3個(gè)細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色[圖2(1)]；免疫組化染色顯示，細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白呈陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)黃色顆粒，細(xì)胞核無(wú)著色[圖2(2)]，表明為軟骨細(xì)胞。

圖2 第3代軟骨細(xì)胞鑒定結(jié)果(×200)

3.3 軟骨細(xì)胞凋亡率測(cè)定結(jié)果4組軟骨細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(25.10±0.47)%，(22.08±0.25)%，(19.37±0.36)%，(16.05±0.58)%，F(xiàn)=13.776，P=0.000]。川芎嗪低、中、高濃度組軟骨細(xì)胞凋亡率均低于對(duì)照組(LSD-t=12.685，P=0.000；LSD-t=21.642，P=0.000；LSD-t=27.107，P=0.000)，川芎嗪中、高濃度組軟骨細(xì)胞凋亡率均低于川芎嗪低濃度組(LSD-t=13.826，P=0.000；LSD-t=21.349，P=0.000)，川芎嗪高濃度組軟骨細(xì)胞凋亡率低于川芎嗪中濃度組(LSD-t=10.875，P=0.000)。見(jiàn)圖3。

圖3 4組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡率測(cè)定結(jié)果

3.4 軟骨細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果4組軟骨細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(吸光度值：0.25±0.04，0.41±0.02，0.54±0.02，0.60±0.01，F(xiàn)=131.875，P=0.000)，川芎嗪低、中、高濃度組軟骨細(xì)胞活力均高于對(duì)照組(LSD-t=8.000，P=0.000；LSD-t=14.500，P=0.000；LSD-t=18.981，P=0.000)，川芎嗪中、高濃度組軟骨細(xì)胞活力均高于川芎嗪低濃度組(LSD-t=10.277，P=0.000；LSD-t=19.000，P=0.000)，川芎嗪高濃度組軟骨細(xì)胞活力高于川芎嗪中濃度組(LSD-t=6.000，P=0.000)。

3.5 軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)分析結(jié)果4組軟骨細(xì)胞Trx-2、ASK-1及Caspase-3的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。川芎嗪低、中、高濃度組軟骨細(xì)胞Trx-2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(mRNA：LSD-t=6.925，P=0.000；LSD-t=15.581，P=0.000；LSD-t=16.046，P=0.000；蛋白：LSD-t=2.479，P=0.000；LSD-t=23.000，P=0.000；LSD-t=33.988，P=0.000)，川芎嗪中、高濃度組軟骨細(xì)胞Trx-2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于川芎嗪低濃度組(mRNA：LSD-t=7.044，P=0.000；LSD-t=9.581，P=0.000；蛋白：LSD-t=6.149，P=0.000；LSD-t=15.321，P=0.000)，川芎嗪高濃度組軟骨細(xì)胞Trx-2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于川芎嗪中濃度組(LSD-t=3.994，P=0.004；LSD-t=18.605，P=0.000)；川芎嗪低、中、高濃度組軟骨細(xì)胞ASK-1和Caspase-3的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(mRNA：LSD-t=8.808，P=0.000；LSD-t=10.398，P=0.000；LSD-t=19.350，P=0.000；LSD-t=3.796，P=0.000；LSD-t=5.096，P=0.000；LSD-t=10.028，P=0.000；蛋白：LSD-t=5.041，P=0.001；LSD-t=13.466，P=0.000；LSD-t=21.719，P=0.000；LSD-t=2.481，P=0.038；LSD-t=7.286，P=0.001；LSD-t=16.865，P=0.000)，川芎嗪中、高濃度組軟骨細(xì)胞ASK-1和Caspase-3的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于川芎嗪低濃度組(mRNA：LSD-t=3.385，P=0.000；LSD-t=20.466，P=0.000；LSD-t=3.400，P=0.000；LSD-t=9.701，P=0.000；蛋白：LSD-t=8.296，P=0.000；LSD-t=17.303，P=0.000；LSD-t=6.228，P=0.000；LSD-t=17.365，P=0.000)，川芎嗪高濃度組軟骨細(xì)胞ASK-1和Caspase-3的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于川芎嗪中濃度組(mRNA：LSD-t=9.550，P=0.005；LSD-t=3.619，P=0.007；蛋白：LSD-t=14.017，P=0.005；LSD-t=4.985，P=0.001)。見(jiàn)表2、圖4。

Trx：硫氧還蛋白；ASK：凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；Caspase：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白；(1)對(duì)照組；(2)川芎嗪低濃度組；(3)川芎嗪中濃度組；(4)川芎嗪高濃度組。

表2 4組骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞Trx-2、ASK-1及Caspase-3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量

4 討 論

OA是一種以關(guān)節(jié)軟骨磨損和關(guān)節(jié)邊緣骨質(zhì)增生為主要病理特征的關(guān)節(jié)疾病[9]。軟骨組織中沒(méi)有神經(jīng)血管，軟骨細(xì)胞增殖與凋亡的平衡維系著軟骨的生理狀態(tài)[10-11]。在OA病理狀態(tài)下，軟骨細(xì)胞增殖與凋亡間的平衡被打破，軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出過(guò)度凋亡，加速了軟骨的破壞[12]。研究表明，細(xì)胞凋亡相關(guān)因子在OA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，抑制膠原蛋白和蛋白多糖的合成與分泌，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷，加速OA的進(jìn)程[13-14]。因此，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡進(jìn)程對(duì)于防治OA具有重要意義。川芎嗪是從川芎中分離出來(lái)的一種生物堿。Fan等[15]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于由高半胱氨酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，川芎嗪可減輕細(xì)胞的氧化損傷，抑制細(xì)胞凋亡。曾利紅等[16]研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能夠有效抑制OA大鼠軟骨細(xì)胞凋亡，在阻止OA病情發(fā)展方面療效顯著。我們研究發(fā)現(xiàn)，隨著川芎嗪濃度增加，OA軟骨細(xì)胞凋亡率下降、活力提高，提示川芎嗪能夠抑制人軟骨細(xì)胞凋亡、提高細(xì)胞活力，且該作用在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴(lài)性。

細(xì)胞凋亡機(jī)制復(fù)雜，Trx-2/ASK-1/Caspase-3信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡的重要通路之一。Trx是一類(lèi)重要的氧化還原調(diào)節(jié)分子，廣泛存在于生物體內(nèi)；Trx-2是Trx家族成員，在調(diào)控細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著重要作用[17]。ASK-1是絲裂原活化蛋白激酶家族成員，活化后的ASK-1能夠激活細(xì)胞凋亡通路，而ASK-1在細(xì)胞內(nèi)與Trx-2結(jié)合形成復(fù)合物，可降低自身活性[18]。Caspase家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者之一，其活化后細(xì)胞凋亡將進(jìn)入不可逆階段，生理狀態(tài)下Caspase-3以無(wú)活性酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，Trx-2/ASK-1復(fù)合物可抑制Caspase-3活化[19]。外界信號(hào)可通過(guò)多種通路激活Caspase-3酶原，促使細(xì)胞凋亡，其中Trx-2/ASK-1/Caspase-3信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，川芎嗪干預(yù)后關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中 Trx-2 的mRNA和蛋白表達(dá)量均升高，而ASK-1、Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)量均降低；提示川芎嗪通過(guò)調(diào)控Trx-2/ASK-1/Caspase-3信號(hào)通路發(fā)揮抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用。

本研究結(jié)果表明，川芎嗪能夠抑制人OA軟骨細(xì)胞的凋亡，提高軟骨細(xì)胞活力，且該作用在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴(lài)性；其作用機(jī)制可能與調(diào)控Trx-2/ASK-1/Caspase-3信號(hào)通路有關(guān)。