胡繼兵， 鄧馨悅， 張英馳， 李文凱*

(1.湖北省紅安縣人民醫(yī)院，湖北 黃岡 438400；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430030)

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是一種退變性疾患，以骨量丟失、骨代謝加快和易發(fā)生骨折為特點[1-2]。PMOP及其相關骨折逐漸成為一個嚴重的公共健康問題和沉重的社會負擔。2015 年中國大陸地區(qū)40歲以上人群骨質疏松癥發(fā)病率為24.62%，約1.4億患病人群[3]。按骨質疏松癥的臨床表現，中醫(yī)學中相近的病癥有“骨痿”、“骨痹”等，以補腎益精、健脾益氣、活血祛瘀為主要治療方法[4-5]。骨龍膠囊含狗腿骨及穿山龍，主用于骨與關節(jié)風寒痹阻、肝腎不足者，有散寒鎮(zhèn)痛、活血祛風及強筋壯骨作用[6]，但尚未見骨龍膠囊治療PMOP的相關文獻報道。本研究擬通過建立去卵巢大鼠骨質疏松模型，評價骨龍膠囊對骨質疏松大鼠骨代謝及骨量的影響，為指導臨床用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 骨龍膠囊(山東東阿阿膠股份有限公司，批號1911004)，生理鹽水制成0.1 g/mL灌胃液；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，生產批號499A)。骨鈣素(BGP)檢測試劑盒(北京奇松生物科技有限公司)；堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒及血鈣、磷檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；肝素、4%多聚甲醛、2%戊巴比妥鈉(武漢博士德生物工程有限公司)。MicroCT(vivaCT 40，瑞士Scanco公司)。

1.2 分組、造模及給藥 48只清潔級2月齡雌性SD大鼠，體質量(170±21)g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗中心提供及飼養(yǎng)，實驗動物生產許可證號SCXK(鄂)2008-0005，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術組，卵巢切除(Ovariectomize, OVX，卵巢切除后大鼠體內雌激素模擬人絕經后骨質疏松)組，陽性對照組(OVX+戊酸雌二醇)，低、中、高劑量骨龍膠囊組(OVX+骨龍膠囊)，每組8只，骨質疏松造模方法同文獻[7]，假手術組不切除卵巢，僅切除少量腹腔內脂肪后關腹。手術后2周大鼠開始灌胃給藥，持續(xù)8周，其中陽性對照組按每天灌服0.09 mg/kg戊酸雌二醇，低、中、高劑量骨龍膠囊組分別每天灌服0.54、0.81、1.08 g/kg骨龍膠囊[骨龍膠囊用于人的最低臨床用量為每天6 g，按照人與大鼠的體表面積換算法(6 g×0.018×5=0.54 g/kg)作為低劑量，取低劑量的2倍作為高劑量，高、低劑量的中間值作為中劑量]，假手術組、OVX組每天灌服等體積生理鹽水，灌胃滿8周后禁食12 h，稱定質量，處死全部大鼠，取心臟動脈血，并留取右側完整股骨標本，4%多聚甲醛固定。

1.3 血清Ca、P、BGP、ALP水平檢測 大鼠心臟取動脈血5 mL，置于含有肝素的抗凝管中，4 ℃、2 000 r/min 離心10 min，取上清液，放置在-80 ℃冰箱中備用，檢測血清Ca、P、BGP、ALP水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 MicroCT檢測 使用Scanco vivaCT 40掃描及分析所有大鼠右側股骨標本，具體方法同文獻[8]，在70 kV、113 mA下使用10.5 μm層厚連續(xù)掃描股骨全長。在區(qū)分骨質和軟組織時，骨小梁和骨皮質的閾值分別設定為180、220。骨小梁的感興趣區(qū)域(ROI)選取從股骨遠端生長板最低點以上10個層面開始，向上連續(xù)選擇10個層面(105 μm)的范圍，骨皮質的感興趣區(qū)域(ROI)選取從股骨干中點向下50個層面(525 μm)的范圍，前者測量參數包括骨小梁相對體積(BV/TV)、骨小梁數量(TB.N)、骨小梁厚度(TB.Th)、骨小梁分離指數(TB.Sp)，后者測量參數包括骨皮質厚度(Ct. Th)、骨皮質相對面積(Ct.Ar/Tt.Ar)。

2 結果

2.1 體質量 48只大鼠術后切口均在1周后愈合，實驗期間無死亡。與假手術組比較，OVX組和低、中、高劑量骨龍膠囊組大鼠體質量均升高(P<0.05)；與OVX組比較，陽性對照組大鼠體質量降低(P<0.05)，低、中、高劑量骨龍膠囊組之間無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質量比較

2.2 骨龍膠囊對卵巢切除大鼠血清中Ca、P、ALP及BGP水平的影響 與假手術組比較，OVX組大鼠血清Ca、P增加(P<0.05)、ALP、BGP減少(P<0.05)；與OVX組比較，低、中、高劑量骨龍膠囊組大鼠血清Ca、P減少(P<0.05)、ALP、BGP增加(P<0.05)，但低、中、高劑量組之間無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清中Ca、P、ALP、BGP水平

2.3 骨龍膠囊對骨質疏松大鼠骨小梁骨量的影響 與假手術組比較，OVX組大鼠骨小梁骨量降低(P<0.05)；與OVX組比較，低、中、高劑量骨龍膠囊組骨小梁骨量升高(P<0.05)，但低、中、高劑量骨龍膠囊組之間無明顯差異(P>0.05)。見圖1。

注：A為假手術組，B為OVX組，C為陽性對照組，D為低劑量骨龍膠囊組，E為中劑量骨龍膠囊組，F為高劑量骨龍膠囊組，G為BV/TV(骨小梁相對體積)，H為Tb.Th(骨小梁厚度)，I為Th.N(骨小梁數目)，J為Tb.Sp(骨小梁分離指數)。與假手術組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05。

2.4 骨龍膠囊對骨質疏松大鼠骨皮質骨量的影響 與假手術組比較，OVX組大鼠骨皮質骨量降低(P<0.05)；與OVX組比較，低、中、高劑量骨龍膠囊組大鼠之間骨皮質骨量無明顯差異(P>0.05)。見圖2。

注：A為假手術組，B為OVX組，C為陽性對照組，D為低劑量骨龍膠囊組，E為中劑量骨龍膠囊組，F為高劑量骨龍膠囊組，G為Ct.Th(骨皮質厚度)，H為Ct.Ar/Tt.Ar(骨皮質相對面積)。與假手術組比較，*P<0.05。

3 討論

近年來許多研究者從分子生物學水平研究中醫(yī)藥治療骨質疏松癥并取得了顯著的進展，大量的基礎及臨床研究證實中醫(yī)藥在治療骨質疏松方面有著獨特的優(yōu)勢[9]。骨龍膠囊主用于骨與關節(jié)風寒痹阻、肝腎不足者，有散寒鎮(zhèn)痛、活血祛風及強筋壯骨作用。唐曉頗等[10]研究發(fā)現骨龍膠囊在改善膝骨性關節(jié)炎的疼痛及功能評分方面療效優(yōu)于維固力膠囊，是一種治療膝骨關節(jié)炎有效、安全的治療藥物。賈玉民等[11]研究發(fā)現骨龍膠囊能有效抑制類風濕性關節(jié)炎大鼠血清IL-1β和TNF-α炎性細胞因子的活性，對類風濕性關節(jié)炎有良好的治療作用。劉海等[12]研究發(fā)現骨龍膠囊聯合甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶治療類風濕性關節(jié)炎并發(fā)骨質疏松能夠有效促進骨形成及抑制骨吸收，增加骨密度，療效顯著優(yōu)于單純西藥治療。本研究發(fā)現骨龍膠囊可以降低骨質疏松大鼠血清中Ca和P的水平、增加血清中ALP和BGP的水平、增加股骨骨小梁的骨量，說明骨龍膠囊有良好的抗骨質疏松作用，這為進一步指導臨床用藥提供了實驗依據。

骨骼的完整性由不斷重復、時空偶聯的骨吸收和骨形成過程維持，此過程稱為“骨重建”。骨吸收過程與破骨細胞聯系緊密，若破骨細胞骨吸收增強，可引起骨中Ca、P的流失，表現為骨量減少，血清Ca、P水平的升高[4]。而骨形成過程與成骨細胞的功能狀態(tài)較密切， BGP和ALP是常用的成骨細胞功能檢測指標。BGP是由成骨細胞分泌的一種特異性非膠原骨基質蛋白，ALP是成骨細胞的一種胞外酶，主要為骨的鈣化提供磷酸，骨型占50%[7-13]。本研究結果顯示與假手術組比較，OVX組大鼠血清Ca和P增加，血清BGP、ALP及股骨骨小梁骨量明顯減少，說明本實驗中去卵巢骨質疏松大鼠造模成功。此外，本研究還發(fā)現與OVX組比較，低、中、高劑量骨龍膠囊組血清Ca和P減少、血清ALP、BGP及股骨骨小梁骨量增加，這說明骨龍膠囊可以有效地促進骨質疏松大鼠的骨形成、減少破骨細胞引起的骨吸收。但同時還發(fā)現，本實驗設立的3個不同劑量骨龍膠囊組間的骨代謝指標差異無統(tǒng)計學意義，這說明骨龍膠囊治療骨質疏松不存在劑量依賴性。

此外，本實驗中，低、中、高劑量骨龍膠囊組雖能使骨質疏松大鼠的骨代謝和骨量得到一定恢復和改善，但與假手術組比較仍有差異。本研究還發(fā)現OVX組與低、中、高劑量骨龍膠囊組間的股骨骨皮質參數沒有明顯差異，以上結果表明單獨使用骨龍膠囊不足以治療卵巢切除引起骨質疏松癥。研究發(fā)現骨質疏松癥如同其他慢性疾病一樣，不僅要長期、個體化治療，也需藥物聯合或序貫治療[14]。因此，不建議單獨使用骨龍膠囊治療PMOP，而是聯合鈣劑、維生素D及其他骨吸收抑制劑或骨形成促進劑聯合使用[2, 15-16]。

本研究仍有一些局限性：首先，本研究中實驗對象是大鼠，實驗數據及結論可能并不完全適用于人類。在確定藥物安全的基礎上，下一步還需要進行多中心、隨機、對照、前瞻性臨床實驗來確定骨龍膠囊對人類骨質疏松的治療效果。其次，骨龍膠囊作為一種復方中藥制劑，單味藥可能僅作用于機體某些環(huán)節(jié)而中藥復方對機體具有全身性調節(jié)、作用于多環(huán)節(jié)和多通路，但具體機制還需進一步研究。