方慧祥

(曲靖市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，云南 曲靖 655000)

利膽片收載于2020年版《中國(guó)藥典》中，由大黃、金銀花、金錢草、木香、知母、大青葉、柴胡、白芍、黃芩、芒硝、茵陳11味中藥加工而成，具有疏肝止痛、清熱利濕之功效，用于肝膽濕熱所致的脅痛，癥見(jiàn)脅肋及胃腹部疼痛、按之痛劇，大便不通、小便短赤，身熱頭痛，嘔吐不食，膽道疾病見(jiàn)上述證候者[1]。方中大黃具有調(diào)節(jié)胃腸道、保肝、心腦血管保護(hù)、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[2]，金銀花具有消炎散熱、抑菌、止血、抗病毒、養(yǎng)肝護(hù)膽、抗氧化等作用[3]，茵陳具有保肝利膽、利濕退黃、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種功效[4]，木香具有保肝利膽、解痙、抗炎、抗腫瘤等作用[5]，白芍具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌等作用[6]，黃芩具有抗菌、抗腫瘤、抑制心腦血管疾病、抗過(guò)敏、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗炎等作用[7]。但利膽片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]及文獻(xiàn)[8]僅對(duì)大黃含量進(jìn)行測(cè)定，文獻(xiàn)[9-10]僅對(duì)黃芩苷含量進(jìn)行測(cè)定，文獻(xiàn)[11-12]僅對(duì)綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定，文獻(xiàn)[13]也僅同時(shí)對(duì)黃芩苷、綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定。因此，本實(shí)驗(yàn)參照2020年版《中國(guó)藥典》[1]及文獻(xiàn)[14-22]，建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定利膽片中綠原酸、芍藥苷、異綠原酸A、黃芩苷、漢黃芩苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、大黃酚的含量，以期為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(配置LC-20AT型輸液泵、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、CBM-20A型控制器、 CTO-10AS vp型柱溫箱、SPD-20A型紫外檢測(cè)器、DGU-20A5型脫氣機(jī)、LCsolution色譜工作站)(日本島津制作所)；MS205型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試劑與藥物 異綠原酸A對(duì)照品(批號(hào)250034-20107，純度98.1%)購(gòu)自上海鴻永生物科技有限公司；綠原酸(批號(hào)110753-201716，純度99.3%)、芍藥苷(批號(hào)110736-201741，純度95.7%)、黃芩苷(批號(hào)110715-201720，純度93.5%)、漢黃芩苷(批號(hào)112002-201702，純度98.5%)、木香烴內(nèi)酯(批號(hào)111524-201710，純度99.5%)，去氫木香內(nèi)酯(批號(hào)111525-201711，純度99.8%)、大黃酚(批號(hào)110796-201621，純度99.2%)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。利膽片(太極集團(tuán)四川綿陽(yáng)制藥有限公司，批號(hào)1712006、1806002、1812007)。乙腈為色譜純(德國(guó)默克公司)；其余試劑均為分析純；水為二次蒸餾水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取綠原酸、芍藥苷、異綠原酸A、黃芩苷、漢黃芩苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、大黃酚對(duì)照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為879.641 1、445.349 6、205.253 7、530.225 4、141.009 6、301.840 2、380.263 0、102.778 1 μg/mL的貯備液，分別精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.2 供試品溶液 取片劑20片，除去包衣，研細(xì)，取約0.6 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，水浴回流50 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按處方比例與工藝，分別制得缺茵陳和金銀花、缺白芍、缺黃芩、缺木香、缺大黃的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Thermo Scientific Hypersil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.1%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～44 min，6%～30%B；44～50 min，30%～54%B；50～70 min，54%～74%B；70～80 min，6%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.3 專屬性試驗(yàn) 吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，陰性樣品在對(duì)照品、供試品色譜峰保留時(shí)間處未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)色譜峰，表明陰性無(wú)干擾，該方法專屬性良好。

1.綠原酸 2.芍藥苷 3.異綠原酸A 4.黃芩苷 5.漢黃芩苷 6.木香烴內(nèi)酯 7.去氫木香內(nèi)酯 8.大黃酚

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、3.0、5.0 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得綠原酸、芍藥苷、異綠原酸A、黃芩苷、漢黃芩苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、大黃酚峰面積RSD分別為0.68%、0.39%、0.67%、0.73%、0.72%、0.84%、0.82%、0.82%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批片劑(批號(hào)1712006)6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得綠原酸、芍藥苷、異綠原酸A、黃芩苷、漢黃芩苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、大黃酚含量RSD分別為0.92%、0.88%、0.85%、0.91%、1.13%、0.76%、0.81%、0.99%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，于0、4、8、16、24 h在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL測(cè)定，測(cè)得綠原酸、芍藥苷、異綠原酸A、黃芩苷、漢黃芩苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、大黃酚峰面積RSD分別為0.58%、0.90%、0.92%、0.73%、0.60%、0.59%、0.52%、0.63%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取各成分含量已知的片劑(批號(hào)1712006)6份，每份約0.3 g，精密稱定，精密加入“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.5 mL、甲醇23.5 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，綠原酸、芍藥苷、異綠原酸A、黃芩苷、漢黃芩苷、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、大黃酚平均加樣回收率分別為100.06%、98.46%、98.94%、97.39%、97.81%、99.37%、99.50%、98.62%，RSD分別為0.56%、0.53%、0.50%、0.59%、0.72%、0.52%、0.48%、0.78%。

2.9 樣品含量測(cè)定 取3批片劑，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 本實(shí)驗(yàn)將對(duì)照品溶液在190～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)綠原酸在220、330 nm，芍藥苷在230 nm，異綠原酸A在219、330 nm，黃芩苷在215、278 nm，漢黃芩苷在275 nm，木香烴內(nèi)酯在207 nm，去氫木香內(nèi)酯在216 nm，大黃酚在225、257 nm處有最大吸收，并且在230 nm處各成分響應(yīng)都較高，能滿足定量要求，參考文獻(xiàn)[14-22]，最終確定其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 提取方法選擇 本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[14-22]，對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)(60%、70%、80%、90%、100%)甲醇、溶劑用量(10、20、40、60、80倍)、提取時(shí)間(30、40、50、60、70 min)、提取方法(回流、超聲)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)40倍量甲醇回流提取50 min時(shí)，各成分均提取完全，回收率可滿足試驗(yàn)要求，最終確定其作為提取方法。

3.3 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)參考2020年版《中國(guó)藥典》[1]及文獻(xiàn)[15-16，20-22]，考察了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸，經(jīng)反復(fù)調(diào)整流動(dòng)相比例及變換梯度，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫時(shí)各成分峰形和分離度均良好，最終確定其作為流動(dòng)相。