譚章斌， 徐由財， 丁文俊， 鄧穗暉， 劉 彬， 張競之

(廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510260)

肝癌是最普遍和最具侵略性的惡性腫瘤之一，大多數(shù)患者確診時已處于中晚期，并發(fā)生局部入侵或遠處轉(zhuǎn)移，失去了根治性手術的機會[1]。靶向藥物是治療中晚期肝癌的主要臨床療法，但目前由于其嚴重的不良反應和耐藥性限制了其應用，故急需開發(fā)新型治療藥物。Src激酶是一種位于細胞內(nèi)的非受體酪氨酸激酶，參與腫瘤生成，與腫瘤細胞增殖、抗凋亡、入侵和轉(zhuǎn)移等活動行為密切相關[2]。蘆薈大黃素是一種從大黃、蘆薈等植物中提取出的化合物，具有多種藥理活性，包括顯著的抗腫瘤作用[3]。本研將考察蘆薈大黃素對肝癌細胞增殖與遷移的影響，以及Src/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號通路在該成分抗肝癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 蘆薈大黃素購自成都曼斯特生物科技有限公司，二甲基亞砜(DMSO, 美國Cell Signaling Technology公司)溶解，本研究以DMSO為溶劑對照組。DMEM、PBS、胎牛血清均購自美國Gibco公司；c-Myc(#9402)、p-Src(#6943)、Src(#2109)、STAT3(#12640)、GAPDH(#5174)一抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；p-STAT3(ab76315)、Cyclin D1(ab134175)、MMP-2(ab97779)、MMP-9(ab76003)一抗均購自英國Abcam公司；MTS(G3582)購自美國Promega公司；EdU染色試劑盒(C10310-3)購自廣州市銳博生物科技有限公司；結晶紫染色試劑盒(KGA229)購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.2 細胞 人SMMC-7721、Hep3B肝癌細胞購自中國科學院上海細胞庫，用DMEM培養(yǎng)，添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液，置于5%CO2、37 ℃加濕細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細胞活性評價 采用MTS法。收集SMMC-7721和Hep3B肝癌細胞，以5×103/mL密度接種到96孔板，細胞貼壁生長后給予不同濃度的蘆薈大黃素，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，加入MTS和DMEM混合溶液(MTS∶DMEM=1∶5)100 μL，在37 ℃下孵育1 h。使用酶標儀讀取器讀取490 nm吸光度，計算細胞活性。

1.4 平板克隆形成 收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的SMMC-7721和Hep3B肝癌細胞，調(diào)整為每皿300個,并在60 mm皿中重新接種。細胞每3 d用10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素干預1次，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d。形成肉眼可見的細胞集落后棄培養(yǎng)基,4%多聚甲醛固定10 min，結晶紫染色10 min，洗凈后晾干、拍照。

1.5 EdU染色 收集SMMC-7721和Hep3B肝癌細胞，在96 孔板(每孔5× 103個)中培養(yǎng)，第2天加入10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)試劑盒說明書棄培養(yǎng)基，加入A液2 h標記細胞，PBS洗滌細胞3次，4%多聚甲醛固定10 min，Apollo染色液和Hochest 33342染色液依次孵育30 min，熒光顯微鏡進行觀察拍照，計算EdU陽性細胞數(shù)。EdU陽性細胞數(shù)=[EdU陽性細胞(紅色)/細胞總數(shù)(藍色)]×100%。

1.6 Transwell細胞遷移實驗 細胞遷移實驗使用24孔板及孔徑為8.0 μm的小室進行，5×105個SMMC-7721肝癌細胞懸浮于無血清DMEM中，播種到上腔室，給予不同濃度蘆薈大黃素，下腔中加入含有10%胎牛血清的DMEM。孵育20 h后，4%多聚甲醛固定細胞，結晶紫對遷移至下室的肝癌細胞染色，在正置顯微鏡下觀察，計算細胞遷移數(shù)。

1.7 蛋白印跡(Western blot) SMMC-7721肝癌細胞在100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)48 h后，10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素處理24 h，預先在RIPA裂解液中添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，冷PBS洗滌2次，裂解液收集處理后的肝癌細胞蛋白，定量后將等量蛋白通過SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)移到聚氯酰胺氟化物(PVDF)膜，用含5% BSA的TBST封閉2 h后，一抗、二抗依次對膜進行孵育，通過增強型化學發(fā)光試劑盒進行檢測。

1.8 分子對接與分子動力學 采用Autodock Vina(美國Scripps研究所)軟件[4]分析Src(PDB ID 1YOL)與蘆薈大黃素(CID 10207)之間的結合相互作用，通過去除水分子和結合的配體來制備Src的分子對接模擬蛋白，使用YASARA進行配體的能量最小化。本研究中Src的抑制劑結合結構域?qū)赟rc的蛋白質(zhì)-配體結合位點，采用YASARA軟件[5]執(zhí)行分子動力學模擬，模擬退火最小化的起始時間設置為298 K，每10步速度將速度降低0.9，持續(xù)5 ps，最小化能量后，使用Berendsen溫控器調(diào)節(jié)系統(tǒng)溫度，以最大程度地降低溫度控制的影響，最后以2 fs速率進行100 ns的MD模擬，每10 ps保存坐標。

1.9 表面等離子共振 使用PlexArray HT系統(tǒng)(美國Plexera)進行表面等離子共振篩選以確定蘆薈大黃素和Src的結合，將Src蛋白打印在3D傳感器芯片上，并通過光穿越反應將其固定，在25 ℃下，以2 μL/s 體積流量流動樣品進行300 s締合，在運行緩沖液中進行300 s解離，以3 μL/s 體積流量運行200 s的再生緩沖液，獲得典型的結合曲線(為了獲得結合親和力，至少用3個濃度流動相依次洗脫)。在折射率變化已知(1 200 RU)的運行緩沖液中，1%甘油校準每個斑點，將所有結合信號轉(zhuǎn)換為標準折射單位(RU)，使用SPRi分析軟件(Plexera SPR數(shù)據(jù)分析模型)收集分析測定數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1 蘆薈大黃素對SMMC-7721和Hep3B肝癌細胞增殖的影響 如圖1A所示，10、40 μmol/L蘆薈大黃素處理后，SMMC-7721和Hep3B肝癌細胞的生存率分別降低到79.52%、88.19%和47.49%、61.29%，并呈濃度依賴性(P<0.05)，作用24 h后兩者IC50分別為37.55、52.58 μmol/L。如圖1B所示，10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素可濃度依賴性地抑制肝癌細胞克隆形成。如圖1C所示，10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素處理24 h后，可呈劑量依賴性的方式抑制SMMC-7721和Hep3B肝癌細胞增殖能力，EdU陽性細胞數(shù)分別為15.32%、23.30%，11.19%、18.45%，6.08%、12.56%，低于對照組的34.27%、39.46%(P<0.05)。由于與Hep3B肝癌細胞比較，SMMC-7721肝癌細胞對蘆薈大黃素更為敏感，故本實驗選用SMMC-7721肝癌細胞探索該成分抗肝癌作用。

注：A為大黃對肝癌細胞活性的影響，B為10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素對肝癌細胞平板克隆形成的影響，C為蘆薈大黃素對肝癌細胞增殖的影響，D為EdU陽性細胞數(shù)比例。與對照組比較，*P<0.05。

2.2 蘆薈大黃素對SMMC-7721肝癌細胞遷移的影響 如圖2所示，蘆薈大黃素減少了SMMC-7721肝癌細胞中遷移細胞的數(shù)量，并呈濃度依賴性；10、20、40 μmol/L蘆薈大黃素組的遷移細胞數(shù)分別為每個視野178.3、136.3、85.6個，低于對照組的每個視野452.6個(P<0.05)。

注：A為肝癌細胞遷移情況，B為肝癌細胞遷移數(shù)。與對照組比較，*P<0.05。

2.3 蘆薈大黃素對肝癌細胞Src/STAT3信號通路的調(diào)控 如圖3所示，蘆薈大黃素能濃度依賴性地抑制SMMC-7721肝癌細胞中Src和STAT3的磷酸化水平，而相應的總蛋白表達不變，也以濃度依賴性的方式抑制Cyclin D1、c-Myc、MMP-2、MMP-9表達，表明Src/STAT3信號通路在蘆薈大黃素抑制 SMMC-7721肝癌細胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。

注：A為蘆薈大黃素對Src/STAT3信號通路激活的影響，B為蘆薈大黃素對Src/STAT3信號通路下游增殖和遷移相關靶蛋白的影響，C為蛋白相對表達量。與對照組比較，*P<0.05。

2.4 Src與蘆薈大黃素的潛在結合作用 目前研究表明，蘆薈大黃素抑制了Src的磷酸化水平，因此推測蘆薈大黃素可能直接與Src蛋白結合，是潛在的Src蛋白抑制劑。本實驗首先采用分子對接技術進行分析，Src和蘆薈大黃素之間的結合能為-8.772 kcal/mol。Src-蘆薈大黃素絡合物三維晶體結構如圖4A所示，可知蘆薈大黃素和Src的ASP-406、GLU-341、GLU-312 之間形成了3個氫鍵。通過分子動力學模擬，進一步研究了Src-蘆薈大黃素蛋白復合物的穩(wěn)定性。Src-蘆薈大黃素絡合物在0、100 ns處的表面可視化模型如圖4C所示，可知Src穩(wěn)定地呈現(xiàn)在Src結合位點的中心，直到分子動力學模擬結束。在最初的20 ns內(nèi)，Src蛋白的均方根偏差(RMSD)從0.5 ?(1 ?=1.0×10-10m)增加到3 ?，并圍繞著3 ?波動(圖4B，紅色線)，而蘆薈大黃素的RMSD則穩(wěn)定在0.5 ?波動(圖4B，藍色線)。此外，表面等離子共振分析表明蘆薈大黃素以濃度依賴方式快速結合Src，平衡解離常數(shù)(KD)值為3.66×10-7mol/L，表明該成分對Src具有很強的親和力，能與后者直接結合。

圖4 Src和蘆薈大黃素結構之間的相互作用

3 討論

在過去70年中，獲得FDA批準用于癌癥治療的小分子化合物中，約有一半是天然藥物或天然藥物的直接衍生物[6-7]。蘆薈大黃素是從中藥大黃中提取的天然化合物，具有抗炎、抗菌、神經(jīng)保護和肝保護等多種藥理作用[8]。此外，蘆薈大黃素在肝癌、肺癌、胃癌及黑色素瘤細胞等不同腫瘤細胞上表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性[3]。杜雪峰等[9]發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素通過促進凋亡相關蛋白Bax、caspase-3的表達誘導SMMC-7721肝癌細胞發(fā)生自噬和凋亡。王曉輝等[10]發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素能夠減少HepG2肝癌細胞中微絲形成，抑制細胞增殖與遷移，其機制可能與蘆薈大黃素上調(diào)NF-κB表達，降低e-NOS活性有關。本研究中采用SMMC-7721和Hep3B肝癌細胞探索蘆薈大黃素抗肝癌作用及其機制。MTS和平板克隆形成實驗結果提示蘆薈大黃素能夠抑制肝癌細胞的活性。EdU染色和Transwell遷移實驗提示蘆薈大黃素抑制肝癌細胞的增殖和遷移能力。最后采用蛋白印跡探索蘆薈大黃素抗肝癌的作用機制，發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素能夠抑制肝癌細胞中Src/STAT3信號通路的激活，以及抑制下游增殖和遷移相關靶蛋白的表達。

Src是非受體蛋白酪氨酸激酶，能被多種受體蛋白激活，通過級聯(lián)反應調(diào)節(jié)一系列下游基因表達，以控制細胞形態(tài)、增殖、粘附、分化和遷移等細胞過程[11]。STAT3是Src級聯(lián)的重要下游之一。Src激酶在惡性腫瘤中異常持續(xù)激活，隨后將STAT3磷酸化，激活的STAT3轉(zhuǎn)入核內(nèi)與DNA結合，促進增殖、抗凋亡，遷移與侵襲等相關目標基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因與多種類型腫瘤的發(fā)生與進展密切有關[12]。江雪梅[13]通過收集153肝癌患者術后標本，發(fā)現(xiàn)激活的Src水平與肝癌的不良預后密切相關。研究發(fā)現(xiàn)使用慢病毒載體抑制腫瘤細胞內(nèi)Src的表達能夠抑制細胞增殖、遷移與侵襲[14]。Finn等[15]使用Src激酶小分子抑制劑達沙替尼作用于多種肝癌細胞系，發(fā)現(xiàn)達沙替尼能夠阻斷細胞周期，誘導肝癌細胞凋亡。陳建新等[16]通過分子對接技術發(fā)現(xiàn)中藥單體10-姜酚能與Src結合，從而抑制Src/STAT3信號通路的激活，抑制HepG2肝癌細胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素能抑制肝癌細胞Src與STAT3的磷酸化表達，并抑制STAT3下游增殖相關蛋白Cyclin D1、c-Myc以及遷移相關蛋白MMP-2、MMP-9的蛋白表達，蘆薈大黃素抑制肝癌細胞增殖與遷移的作用可能是通過抑制Src/STAT3信號通路。

Western blot結果發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素抑制磷酸化Src的激活，而不抑制總Src蛋白的表達，提示蘆薈大黃素可能直接靶向Src。本研究通過分子對接和分子動力學模擬，以確定蘆薈大黃素能否結合Src的蛋白激酶域。分子對接和分子動力學模擬常用于分析生物活性分子與靶蛋白或受體之間的潛在相互作用形式，并了解他們的結合模式[17-18]。蘆薈大黃素與Src的對接研究表明蘆薈大黃素-Src復合物的結合能為-8.772 kcal/mol，表明二者具有很強的結合能力。此外，分子動力學模擬結果表明，蘆薈大黃素-Src結合構象穩(wěn)定。表面等離子共振分析是一種新型的生物分析工具，用于分析蛋白質(zhì)、DNA、酶和其他生物分子之間的相互作用[19]。表面等離子共振分析發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素與Src之間具有很強的親和力。以上結果提示蘆薈大黃素能與Src直接結合，是一個潛在的Src抑制劑。

綜上所述，蘆薈大黃素通過抑制Src/STAT3信號通路抑制肝癌細胞增殖與遷移，從而發(fā)揮其抗肝癌作用，是治療肝癌的有效藥物。