江 利， 姜夢(mèng)婕， 韓 克

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬泰康仙林鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210000)

慢性盆腔炎是婦科常見疾病，是女性生殖器官及周圍組織出現(xiàn)的炎癥，主要包括子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、盆腔腹膜炎等[1]。臨床常表現(xiàn)為易疲勞、下腹墜痛、白帶增多等。嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致不孕。由于慢性盆腔炎具有久治難愈，易反復(fù)的特點(diǎn)，對(duì)患者身心帶來嚴(yán)重傷害[2]。目前慢性盆腔炎常見的西醫(yī)治療方法以抗生素為主，雖然具有一定療效，但是易產(chǎn)生耐藥性，難以治愈[3]。

中醫(yī)認(rèn)為慢性盆腔炎是陰陽(yáng)失調(diào)、火毒濕熱、氣滯血瘀所引起，桂枝茯苓丸主治氣於經(jīng)閉，適用于消癥。有研究表明，桂枝茯苓丸加減可改善慢性盆腔炎患者臨床體征，緩解疼痛感，并且藥物安全性高[4]。桂枝茯苓丸治療慢性盆腔炎的作用機(jī)制尚有待研究。有研究表明，終止或緩解炎性反應(yīng)與細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)，其中半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)參與細(xì)胞凋亡，并在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[5]。本研究探討桂枝茯苓丸對(duì)慢性盆腔炎大鼠炎癥反應(yīng)的影響及子宮組織caspase-3、caspase-8表達(dá)的變化，為桂枝茯苓丸在臨床治療上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 90只8～12周齡無特定病原體(SPF)級(jí)Wistar雌性大鼠，體質(zhì)量210～230 g，購(gòu)自北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2018-0010。

1.2 菌株 大腸桿菌ATCC25922與金黃色葡萄球菌ATCC25923均購(gòu)自中國(guó)國(guó)家菌種庫(kù)。

1.3 藥物與試劑 桂枝茯苓丸購(gòu)自成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20027562)；左氧氟沙星購(gòu)自北京第一三共制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H20000655)。大鼠白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D systems公司(批號(hào)R180412、R180622、R180703)；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司(批號(hào)201806A)；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司(批號(hào)20180413)；核糖核酸(RNA)提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司(批號(hào)180126)；蛋白提取試劑盒購(gòu)自深圳子科生物科技有限公司(批號(hào)20181018)；蛋白質(zhì)免疫印跡法(WB)試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司(批號(hào)R201807045)。引物合成委托蘇州泓迅生物科技股份有限公司。

1.4 儀器 BX43光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；Sunrise酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan公司；RM2125RTS切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；KH20R高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；CFX96Touch熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀購(gòu)自美國(guó)伯樂公司。

2 方法

2.1 造模與給藥 從90只SPF級(jí)Wistar雌性大鼠中隨機(jī)挑選75只建立慢性盆腔炎模型[6]。大鼠麻醉后，使用磨去針頭尖的10 mL注射器針頭從陰道底部的子宮頸分叉處進(jìn)入一側(cè)宮腔，并子宮腔內(nèi)來回劃2次，造成子宮內(nèi)膜組織機(jī)械性損傷，使用2×109個(gè)/mL金黃色葡萄球菌和大腸桿菌1∶1混合菌液0.1 mL從子宮子宮另一側(cè)宮腔方向注入，倒置2 min以防菌液漏出；余下15只記作假手術(shù)組，不進(jìn)行機(jī)械損傷，僅向子宮腔內(nèi)注射0.1 mL的生理鹽水。于建模后第7天隨機(jī)挑出3只建模大鼠，取子宮組織，HE染色觀察病理變化，以判斷建模是否成功。將建模成功大鼠隨機(jī)分為模型組，左氧氟沙星組，桂枝茯苓丸高、中、低劑量組，桂枝茯苓丸高、中、低劑量組分別給予18、9、4.5 g/kg桂枝茯苓丸混懸于生理鹽水中灌胃，左氧氟沙星組給予30 mg/kg左氧氟沙星溶于生理鹽水中灌胃，假手術(shù)組和模型組灌胃等量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥21 d。

2.2 血清促炎因子檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，在給藥前后檢測(cè)大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。取大鼠尾靜脈血，室溫靜置2 h，1 000×g離心20 min，上層清液即為血清。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處讀取各樣品OD值。

2.3 子宮病理學(xué)觀察 將大鼠頸椎脫臼處死，剖取子宮，在4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)過脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、復(fù)水后，按照試劑盒說明書進(jìn)行HE染色，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.4 子宮細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 切片制備過程同“2.3”項(xiàng)下，復(fù)水后按照TUNEL試劑盒說明書操作，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察。選取隨機(jī)不重疊的5個(gè)視野，使用配套計(jì)算機(jī)軟件分析細(xì)胞凋亡率。

2.5 子宮caspase-3、caspase-8 mRNA表達(dá)檢測(cè) 取大鼠子宮組織，加入少許液氮研磨勻漿，使用RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒，提取組織中的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI Genebank中的目的基因mRNA序列，設(shè)計(jì)出正反向引物。caspase-3正向引物為5′-AGACTAGGATCGATACCATT-3′，反向引物為5′-TTGATCGATCAATCGATGCCAT-3′；caspase-8正向引物為5′-TACCTGCTAATCGATTACAGCC-3′，反向引物為5′-GTAGTCCATGATACAGGTTA-3′；β-actin正向引物為5′-TGATAGGCCATAATCCGATAG-3′，反向引物為5′-GATTGCTTAAGCTAAGGATC-3′。反應(yīng)體系為cDNA 1 μL，dNTP 1 μL，配套熒光預(yù)混劑1 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 15 μL，總體積20 μL。經(jīng)過預(yù)變性95 ℃ 3 min，40個(gè)循環(huán)條件為解鏈95 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s。通過配套熒光采集系統(tǒng)檢測(cè)樣本CT值，并以β-actin為內(nèi)參計(jì)算目的基因表達(dá)。

2.6 子宮caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8蛋白表達(dá)檢測(cè) 取大鼠子宮組織，加入少許液氮研磨勻漿，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，加入上樣緩沖液，于沸水中煮沸變性處理5 min。按照WB檢測(cè)試劑盒說明書操作，經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗處理后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色，使用QuantityOne軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參得出目的蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 血清促炎因子水平 大鼠造模過程中出現(xiàn)4只死亡，解剖發(fā)現(xiàn)大量腹水。分組情況為假手術(shù)組15只，左氧氟沙星組、模型組和桂枝茯苓丸高劑量組各14只，桂枝茯苓丸中、低劑量組各13只，模型組由于灌胃操作不當(dāng)導(dǎo)致1只大鼠死亡。大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平：給藥后左氧氟沙星組，桂枝茯苓丸高、中、低劑量組均低于給藥前；給藥前，模型組、左氧氟沙星組和桂枝茯苓丸高、中、低劑量組均高于假手術(shù)組；給藥后，模型組均高于假手術(shù)組(P<0.01)，左氧氟沙星組與桂枝茯苓丸高、中、低劑量組均低于模型組(P<0.01)，與左氧氟沙星組比較，桂枝茯苓丸高劑量組降低(P<0.01)，低劑量組升高(P<0.01)，見表1。

表1 給藥前后大鼠血清促炎因子水平

3.2 大鼠子宮組織病理學(xué)觀察 假手術(shù)組子宮內(nèi)膜無充血、上皮組織結(jié)構(gòu)清晰完整，上皮細(xì)胞排列整齊；模型組可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，子宮內(nèi)膜擴(kuò)張充血，纖維結(jié)締組織增生嚴(yán)重；左氧氟沙星組與桂枝茯苓丸中劑量組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，子宮內(nèi)膜充血減輕，纖維組織減少；桂枝茯苓丸高劑量組炎性浸潤(rùn)減少，子宮內(nèi)膜輕度充血，未見結(jié)締組織增生；桂枝茯苓丸低劑量組較明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，子宮內(nèi)膜輕度充血，結(jié)締組織增生明顯，見圖1。

圖1 大鼠子宮病理切片(HE染色，×400)

3.3 大鼠子宮細(xì)胞凋亡率 模型組細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組(P<0.01)；左氧氟沙星組和桂枝茯苓高、中、低劑量組均高于模型組(P<0.01)；與左氧氟沙星組比較，桂枝茯苓丸高劑量組升高(P<0.01)，低劑量組降低(P<0.01)，見圖2、表2。

圖2 子宮組織細(xì)胞凋亡(TUNEL，×400)

表2 各組細(xì)胞凋亡率

3.4 子宮caspase-3、caspase-8 mRNA表達(dá)caspase-3、caspase-8 mRNA表達(dá)為模型組高于假手術(shù)組(P<0.01)；左氧氟沙星組和桂枝茯苓丸高、中、低劑量組均高于模型組(P<0.05，P<0.01)；與左氧氟沙星組比較，桂枝茯苓丸高劑量組升高(P<0.01)，低劑量組降低(P<0.01)，見表3。

表3 子宮caspase-3、caspase-8 mRNA表達(dá)

3.5 子宮caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8蛋白表達(dá) 子宮caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8蛋白表達(dá)為模型組高于假手術(shù)組(P<0.05)；左氧氟沙星組與桂枝茯苓丸高、中、低劑量組均高于模型組(P<0.05)；與左氧氟沙星組比較，桂枝茯苓丸高劑量組升高(P<0.05)，低劑量組降低(P<0.05)，見圖3、表4。

表4 子宮caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8蛋白表達(dá)

圖3 子宮caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8蛋白表達(dá)

4 討論

慢性盆腔炎主要病原體來源有2類。一類是來自陰道寄居菌群如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等，另一類來自性傳播病原如沙眼衣原體、淋病奈氏菌等[7]。目前針對(duì)慢性盆腔炎的治療以抗生素為主，但是抗生素的療效尚不能令人滿意，此外其毒副作用明顯，因此，需要尋找高效低毒的替代藥物。有研究表明桂枝茯苓丸配合抗生素在慢性盆腔炎臨床治療中表現(xiàn)出顯著療效，但其作用機(jī)制尚未探明[8-9]。研究桂枝茯苓丸對(duì)慢性盆腔炎的治療效果及其機(jī)制，首先需要復(fù)制與臨床接近的慢性盆腔炎模型。本研究選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合液感染加機(jī)械損傷的方法建立大鼠慢性盆腔炎模型[10]可以較好模擬臨床病理過程。

中醫(yī)認(rèn)為，慢性盆腔炎由于瘀血阻滯，寒濕凝滯所致[11]。桂枝茯苓丸的主要成分有桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、芍藥，以桂枝、茯苓為君藥。桂枝可散寒止痛，溫通經(jīng)脈；茯苓可安神健脾，利尿除濕；牡丹皮可活血化瘀，清熱涼血；桃仁可潤(rùn)腸通便，活血化瘀；芍藥可化瘀消腫，清熱止痛。五味藥聯(lián)合使用，具有溫養(yǎng)祛邪、活血化瘀、緩解消癥的功效[12-13]。因此，本研究使用桂枝茯苓丸治療慢性盆腔炎具有可行性。左氧氟沙星為廣譜類抗生素，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有較好抗菌作用，是臨床治療慢性盆腔炎常用藥物，因此選用左氧氟沙星作為本研究的陽(yáng)性對(duì)照具有可比性。

IL-1β、IL-6和TNF-α均為細(xì)胞因子，均發(fā)揮促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加劇組織炎性浸潤(rùn)的作用[14]。IL-1β在正常組織中水平很低，當(dāng)發(fā)生組織損傷或炎癥反應(yīng)時(shí)，IL-1β會(huì)大量產(chǎn)生并進(jìn)一步誘導(dǎo)下游促炎因子的釋放[15]。IL-6可與中性粒細(xì)胞結(jié)合，使中性粒細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，進(jìn)而激活機(jī)體炎癥反應(yīng)，加劇組織病理?yè)p傷[16]。TNF-α既是促炎因子又是巨噬細(xì)胞活化因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。TNF-α雖然有利于機(jī)體抗病原體感染，但過量可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生病變[17]。有研究表明，慢性盆腔炎患者血清中TNF-α水平與組織損傷成正比[18]。本研究中慢性盆腔炎大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高，而經(jīng)過桂枝茯苓丸治療后，IL-1β、IL-6和TNF-α水平均降低。由此表明，桂枝茯苓丸可抑制炎癥反應(yīng)。

炎癥的抑制與消除的過程與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。本研究TUNEL結(jié)果表明，桂枝茯苓丸治療后大鼠子宮組織細(xì)胞凋亡率升高。由此可證，桂枝茯苓丸可促大鼠子宮組織細(xì)胞凋亡。當(dāng)炎性反應(yīng)發(fā)生時(shí)，促凋亡因子caspase-8可被蛋白酶剪切成為cleaved caspase-8，cleaved caspase-8可剪切caspase-3形成cleaved caspase-3，cleaved caspase-3可活化Bcl-2家族引起促炎細(xì)胞凋亡，從而抑制炎癥反應(yīng)，有利于炎癥的吸收消散[19]。caspase-8可抑制炎性小體NLRP3和Ⅰ型干擾素信號(hào)通路，從而抑制如IL-1β、IL-6、TNFα等促炎因子的釋放，此外，caspase-8還可促進(jìn)細(xì)胞增殖，有利于炎癥損傷組織修復(fù)[20]。有研究表明，caspase-3和caspase-8參與大鼠慢性盆腔炎消退的過程[21]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過桂枝茯苓丸治療后，大鼠子宮組織中caspase-3和caspase-8表達(dá)均升高。由此推測(cè)，桂枝茯苓丸治療慢性盆腔炎的作用機(jī)制可能與上調(diào)caspase-3和caspase-8表達(dá)有關(guān)。

綜上所述。桂枝茯苓丸可抑制慢性盆腔炎大鼠炎癥反應(yīng)，改善子宮組織病變，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)慢性盆腔炎具有治療作用，推測(cè)其作用機(jī)制可能與上調(diào)caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8表達(dá)有關(guān)。但由于細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)途徑較多，本研究?jī)H對(duì)caspase-3和caspase-8表達(dá)進(jìn)行研究，桂枝茯苓丸是否影響其他細(xì)胞凋亡途徑尚未可知，仍需進(jìn)一步研究。