努力比亞·阿不都克尤木， 胡利萍， 秦冬梅， 魯曉擘*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，新疆 烏魯木齊 830000；2.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002)

免疫性肝損傷(immunological liver injury，ILI)是一種較為常見的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為肝臟組織內(nèi)出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤，同時(shí)轉(zhuǎn)氨酶、炎癥因子水平大幅度升高等[5]，是肝纖維化、肝硬化以及肝臟腫瘤等發(fā)生的重要因素，也是肝臟疾病發(fā)展的重要過程。近年來，國內(nèi)外對(duì)紫草的研究表明，紫草素具有良好的抗炎、抑菌、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能等多種功效[6]。魯明霞等[7]研究表明紫草素可下調(diào)四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1的表達(dá)，從而抑制大鼠肝纖維化的發(fā)生。但是紫草素毒性較強(qiáng)，而其藥理作用又不具特異性，因而在臨床上未能推廣應(yīng)用。左旋紫草素與紫草素互為旋光異構(gòu)體，其在藥理作用方面有著許多相似之處，但是左旋紫草素的保肝作用研究卻相對(duì)較少，藥理毒性也知之甚少，因此本研究利用刀豆蛋白A (concanavalin A，ConA)誘導(dǎo)小鼠模擬免疫性肝損傷模型，研究左旋紫草素對(duì)小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用，為紫草的藥用價(jià)值開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 5426XG離心機(jī)、Galaxy-170S型CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國Eppendorf公司)；3001全波長掃描多功能讀數(shù)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；BP211D分析天平(德國Sartorius公司)；電熱水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；BCD-272AY容聲冰箱(廣東海信家電集團(tuán)股份有限公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.2 藥物、細(xì)胞與試劑 左旋紫草素(含量≥98%，批號(hào)200506)購自中國食品藥品檢定研究院。甘草酸二銨膠囊(批號(hào)180327302)購自江蘇正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司。小鼠巨噬細(xì)胞株(RAW264.7)由新疆醫(yī)科大學(xué)保存。DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)8118344)、胎牛血清(批號(hào)1828728)均購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；青鏈霉素(批號(hào)SV30010)、胰酶(批號(hào)SH3004201)均購自美國HyClone公司；DMSO(批號(hào)D8371)購自北京索萊寶科技有限公司；刀豆蛋白A(ConA)(批號(hào)C2272)購自美國Sigma公司；MDA(批號(hào)20170105)、T-SOD(批號(hào)20170105)、AST(批號(hào)20170112)、ALT(批號(hào)20170112)、AKP(批號(hào)20170115)、GST(批號(hào)20161211)、考馬斯亮藍(lán)(批號(hào)20160112)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；小鼠白介素1β(IL-1β，批號(hào)20170117)、小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α，批號(hào)20161205)、小鼠γ干擾素(IFN-γ，批號(hào)20170115)試劑盒均購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物 昆明種小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2) g，購自新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(新)2016-0001，自由飲水，適應(yīng)飼養(yǎng)2 d準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW 264.7細(xì)胞加到含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2下常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

2.2 MTT法檢測(cè)左旋紫草素對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的毒性 將細(xì)胞以每孔1×105個(gè)密度接種在96孔板中孵育過夜，加入含不同濃度左旋紫草素的培養(yǎng)基溶液處理24 h，小心吸去培養(yǎng)液，加入含10% MTT溶液的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清，每孔加入110 μL Formazan 溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀在490 nm 波長處測(cè)量各孔光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為細(xì)胞存活率=(OD1/OD0)×100%(OD1為各處理組，OD0為正常培養(yǎng)細(xì)胞)。

2.3 左旋紫草素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響 將細(xì)胞以每孔1×105個(gè)密度接種在96孔板中孵育過夜，用合適濃度的左旋紫草素預(yù)處理30 min，每孔加入LPS(1 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液，與等體積Griess試劑混合，5 min內(nèi)使用酶標(biāo)儀在550 nm波長處測(cè)量每孔OD值[8]。

2.4 分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，陽性藥組(100 mg/kg甘草酸二銨膠囊)，左旋紫草素低、中、高劑量組(0.4、0.8、1.6 mg/kg)，每組10只，雌雄各半，正常組、模型組小鼠每天同一時(shí)間灌胃生理鹽水0.5 mL/只，陽性藥組、左旋紫草素高、中、低劑量組每天灌胃相應(yīng)藥物1次，連續(xù)7 d。最后1次給藥后1 h，除正常組外其余各組小鼠尾靜脈注射ConA(18 mg/kg)形成急性免疫性肝損傷模型，正常組小鼠注射等量生理鹽水，禁食不禁水，8 h后處死取材，并檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

環(huán)境承載力(ELR)是指經(jīng)濟(jì)投入能值加上不可更新資源能值(F+T+N)與可更新環(huán)境資源能值(R)的比率，該數(shù)值不僅可以反映生態(tài)經(jīng)濟(jì)系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)對(duì)環(huán)境系統(tǒng)的壓力，而且可以反映其農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)自然資源的充分利用程度。2010年河南省環(huán)境承載力為4.44，低于發(fā)達(dá)國家平均水平，說明河南省的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)環(huán)境壓力的較小，且具有較大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.5 取材 造模結(jié)束后8 h，稱定小鼠體質(zhì)量，眼眶取血，3 000 r/min離心10 min分離血清，在4 ℃下保存，用于檢測(cè)肝臟指標(biāo)[9]。再將小鼠頸椎脫臼處死，取部分肝臟組織，10%福爾馬林固定以制備病理切片，再取肝臟右葉相同部位小塊組織約0.5 g，4 ℃冷生理鹽水沖洗浮血，加10倍量冰冷生理鹽水研磨勻漿，置于冷凍離心機(jī)中，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，在4 ℃下保存[10]。

2.6 指標(biāo)檢測(cè)

2.6.1 肝臟、脾臟指數(shù) 將小鼠肝臟、脾臟置于生理鹽水中清洗，濾紙吸干血水后置于稱量紙上，電子天平稱定質(zhì)量，計(jì)算肝臟、脾臟指數(shù)[11]，公式分別為肝臟指數(shù)=(肝臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量)×100%、脾臟指數(shù)=(脾臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量)×100%。

2.6.2 血清和肝臟組織勻漿炎癥因子、轉(zhuǎn)氨酶水平 將小鼠肝臟組織勻漿，檢測(cè)蛋白濃度，采用硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)丙二醛(MDA)水平，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性，血清AST、ALT、AKP、GST水平檢測(cè)嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，ELISA法檢測(cè)肝臟組織勻漿IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平。

2.6.3 肝臟組織病理學(xué) 處死小鼠后取肝臟組織，置于福爾馬林中固定48 h，石蠟包埋切片，用HE、VG染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

3 結(jié)果

3.1 左旋紫草素對(duì)RAW 264.7細(xì)胞存活率、NO水平的影響 如圖1所示，左旋紫草素濃度小于200 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率大于90%，而在250、300、400 μmol/L時(shí)均表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率分別為54.8%、31.6%、25.0%，故本實(shí)驗(yàn)采用50、100、200 μmol/L左旋紫草素進(jìn)行研究。與對(duì)照組(0 μmol/L左旋紫草素，1 μg/mL LPS)比較，100、200 μmol/L左旋紫草素均能降低由LPS刺激產(chǎn)生的NO水平(P<0.01)。

注：與對(duì)照組(0 μmol/L左旋紫草素，1 μg/mL LPS)比較，**P<0.01。

3.2 左旋紫草素對(duì)小鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響 如表1所示，與正常組比較，模型組小鼠肝臟、脾臟系數(shù)均升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、左旋紫草素高劑量組小鼠肝臟、脾臟指數(shù)均下降(P<0.05，P<0.01)，而中、低劑量組兩者無明顯變化(P>0.05)。

表1 左旋紫草素對(duì)小鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響

3.3 左旋紫草素對(duì)小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平的影響 如圖2所示，與正常組比較，模型組小鼠血清AST、ALT、GST、AKP水平均升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，陽性藥組、左旋紫草素高劑量組均能降低AST、ALT、GST、AKP水平(P<0.05，P<0.01)，中劑量組僅能降低AST水平(P<0.05)，低劑量組AST、ALT、GST、AKP水平無明顯變化(P>0.05)。

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.4 左旋紫草素對(duì)小鼠肝臟組織勻漿T-SOD活性及MDA、白蛋白水平的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組小鼠T-SOD活性、白蛋白水平降低(P<0.05，P<0.01)，MDA水平升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥組、左旋紫草素高劑量組均能增加T-SOD活性(P<0.05)，降低MDA水平(P<0.05)，升高白蛋白水平(P<0.01)，而中、低劑量組無明顯變化(P>0.05)。

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.5 左旋紫草素對(duì)小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平的影響 如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥組能降低TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平(P<0.05)，左旋紫草素高劑量組能降低IFN-γ水平(P<0.05)，各劑量組均能降低TNF-α水平(P<0.01)，雖然有降低IL-1β水平的趨勢(shì)，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.6 左旋紫草素對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝臟病理的影響 圖5～6顯示，正常組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)清晰，肝索分布規(guī)律，肝細(xì)胞形態(tài)正常無變性且排列有序，炎癥細(xì)胞浸潤較少[12]；模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞，形成纖維縱隔和假小葉，肝索排列紊亂，很多肝細(xì)胞變性，呈現(xiàn)腫脹壞死，邊界模糊，肝細(xì)胞胞漿發(fā)生紅染；與模型組比較，陽性藥組小鼠肝臟組織有所改善，肝細(xì)胞排列比較規(guī)則，肝細(xì)胞間隔變窄，肝細(xì)胞的胞質(zhì)均勻，炎性浸潤程度減輕；左旋紫草素各劑量組均可不同程度減輕小鼠肝組織病變，以高劑量組最明顯，肝小葉可見，炎性浸潤減輕，肝細(xì)胞形態(tài)較為正常，肝細(xì)胞索排列較為有序。

圖5 各組小鼠肝組織病理組織學(xué)變化(HE，×200)

圖6 各組小鼠肝組織病理組織學(xué)變化(VG，×400)

4 討論

機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)介導(dǎo)的肝損傷是許多肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，研究表明自由基、酶以及脂質(zhì)過氧化等均可引起肝臟免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死[13]。 ConA誘導(dǎo)的小鼠急性免疫性肝損傷是近年來較為理想的免疫性肝損傷模型，具有操作簡單、易重復(fù)、模型成功率高等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)常作為研究保肝藥物的模型[14]。本實(shí)驗(yàn)采用尾靜脈注射ConA的方法建立小鼠免疫性肝損傷模型，實(shí)驗(yàn)中模型組AST、ALT水平等均升高，病理組織學(xué)顯示肝細(xì)胞嚴(yán)重壞死，證明肝功能損傷嚴(yán)重，造模成功。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，紫草具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗腫瘤等作用[15-16]。其富含的萘醌類化合物具有較好的保肝降酶作用，有望成為治療肝炎的有效藥物[17]。本實(shí)驗(yàn)首先利用RAW264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行左旋紫草素體外抗炎活性初篩。炎癥是伴隨肝臟疾病的一種常見病理反應(yīng)，RAW264.7細(xì)胞是主要的炎性細(xì)胞，也是免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)過量的NO會(huì)促進(jìn)炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展[18]，因此，抑制NO的釋放可能是緩解炎癥反應(yīng)的重要途徑[19-20]。本實(shí)驗(yàn)中左旋紫草素可以降低由LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO相對(duì)水平，初步說明左旋紫草素體外具有一定的抗炎活性。

體內(nèi)采用ConA誘導(dǎo)建立的小鼠免疫性肝損傷模型，與模型組比較，左旋紫草素能改善小鼠肝臟轉(zhuǎn)氨酶水平，同時(shí)升高T-SOD活性，降低MDA水平(P<0.05)。MDA 是機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物，其水平可以反映細(xì)胞或組織受氧化損傷的嚴(yán)重程度，SOD具有消除單線態(tài)氧的作用，是體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線，可以阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生[21-22]，該結(jié)果表明左旋紫草素的保肝作用與其抗氧化作用相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，左旋紫草素能降低小鼠血清IFN-γ(P<0.05)、TNF-α(P<0.01)的水平。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞分泌，它在血清的濃度與機(jī)體的炎癥嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，是檢測(cè)炎癥細(xì)胞的關(guān)鍵指標(biāo)[23]。炎性因子的過度表達(dá)也是造成肝損傷的原因之一，有報(bào)道稱抑制TNF-α的生成，在減輕肝損傷，緩解肝纖維化中具有重要意義[24]，因此進(jìn)一步證明左旋紫草素在體內(nèi)也具有抗炎活性，并且與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合表明左旋紫草素的保肝作用與其抗炎作用相關(guān)。

綜上所述，左旋紫草素在無細(xì)胞毒性的情況下能通過降低轉(zhuǎn)氨酶水平、減少炎癥因子的釋放等作用保護(hù)由ConA引起的小鼠免疫性肝損傷。