丁元元， 趙 霞*， 邢瓊瓊， 董盈妹， 紀(jì)建建， 梁眾擎

[1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科研究所，江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023]

兒童變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)屬中醫(yī)“鼻鼽”范疇，是一種以突然鼻癢、打噴嚏、流涕和鼻塞為主要臨床表現(xiàn)的過(guò)敏性疾病，其對(duì)小兒生活質(zhì)量、成長(zhǎng)健康及心理狀態(tài)的負(fù)面影響持久而深遠(yuǎn)[1]。兒童過(guò)敏性疾病的負(fù)擔(dān)已成為醫(yī)療保健系統(tǒng)面臨的主要挑戰(zhàn)之一[2]。近年變應(yīng)性鼻炎日趨成為兒童主要的呼吸道慢性疾病[3]，由于兒童自身的特性，變應(yīng)性鼻炎的鼻塞癥狀難以持久改善，對(duì)患兒的成長(zhǎng)及頜面部發(fā)育會(huì)產(chǎn)生終身影響[4]，現(xiàn)西藥治療變應(yīng)性鼻炎以類固醇制劑、抗組胺類藥物和白三烯抑制劑為主，有作用靶點(diǎn)單一、療效短暫、副作用較多缺陷。中國(guó)的兒科人群中使用中藥的比例很高[5]，大量的臨床研究已經(jīng)證明中醫(yī)藥治療變應(yīng)性鼻炎安全有效[6]，中醫(yī)藥對(duì)癥治療獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。鼻敏通竅方在臨床應(yīng)用多年，其療效穩(wěn)定、持久，尤可長(zhǎng)效改善鼻塞癥狀，臨床療效顯著。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型，從免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)和嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)的角度，初步探討鼻敏通竅方治療小兒變應(yīng)性鼻炎的作用機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物 BALB/c小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，雌性，SPF級(jí)，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2017-0001。

1.2 藥物 鼻敏通竅方，由蒼耳子6 g、辛夷6 g(包煎)、川芎6 g、白芷10 g、防風(fēng)6 g、白芍10 g、烏梅10 g、生石膏15 g組成，由北京同仁堂有限公司南京店提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉圣金副教授鑒定為正品，藥材依次加8、6倍量水浸泡1 h后煮沸2次，每次約30 min，過(guò)濾后并濃縮濾液至2 g/mL，裝于無(wú)菌瓶中，置于4 ℃冰箱中冷藏備用。孟魯司特鈉顆粒，購(gòu)自杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)J20140167，蒸餾水溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 儀器 ELX800酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；電子分析天平(CPA2250)，購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司；-80 ℃超低溫冰箱，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；移液器，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；恒溫振蕩儀(THZ-C)，購(gòu)自太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；Accuri C6 Plus流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.4 試劑 氫氧化鋁凝膠，購(gòu)自西安赫特科技有限公司；卵清蛋白(OVA grade V)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號(hào)LTS1092-200；流式熒光表面抗體CD11C-FITC、Siglec-F-APC(鼠抗)，購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 50只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為空白組(8只)、模型組(8只)、孟魯司特鈉組(8只)、鼻敏通竅方低劑量組(8只)、鼻敏通竅方中劑量組(9只)，鼻敏通竅方高劑量組(9只)，參考文獻(xiàn)[7]報(bào)道建立小鼠變應(yīng)性鼻炎模型。除空白組外，各組小鼠在第0、7、14天腹腔注射0.2 mL致敏液(含OVA 40 μg、氫氧化鋁凝膠1.5 mg，溶于生理鹽水中)，第21天雙側(cè)滴鼻OVA溶液(含200 μg OVA)40 μL/只，連續(xù)7 d，正常組小鼠以同體積0.9%氯化鈉溶液代替。每次滴鼻激發(fā)5 h后，空白組，模型組，鼻敏通竅方高、中、低劑量組(2、1.5、1 g/mL)，孟魯司特鈉組(1.35 mg/kg)小鼠每天灌胃給藥1次，共7 d。

2.2 樣品制備 小鼠末次灌胃給藥、禁食不禁水24 h后，摘除眼球取血，3 000 r/min離心10 min，取上清保存于-80 ℃冰箱中，外周血加入小鼠淋巴細(xì)胞分離液，梯度離心法分離收集PBMC。脫頸椎處死小鼠，取鼻黏膜組織，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，病理切片進(jìn)行HE染色。

2.3 指標(biāo)檢測(cè) ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IgE水平，相關(guān)試劑盒由杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司提供，操作嚴(yán)格按要求進(jìn)行。分離出的PBMC用PBS緩沖液洗滌，離心，重懸，加入流式熒光抗體Siglec-F-APC，CD11c-FITC標(biāo)記，篩網(wǎng)過(guò)濾后5 min內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，分析EOS比例。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)評(píng)分 在小鼠末次鼻腔激發(fā)致敏后立即觀察30 min，記錄噴嚏、流涕、抓鼻情況，疊加量化計(jì)分法計(jì)分，總分超過(guò)5分表示造模成功，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，模型組小鼠癥狀行為學(xué)評(píng)分高于空白組(P<0.05)，孟魯司特鈉組、鼻敏通竅方組小鼠癥狀行為學(xué)評(píng)分低于模型組(P<0.05)。

表1 行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

3.2 小鼠鼻黏膜病理學(xué)變化

3.2.1 鼻黏膜組織病理學(xué)評(píng)分 由病理讀片工作人員隨機(jī)觀察各組4個(gè)高倍視野下EOS、肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞、纖毛、杯狀細(xì)胞情況，以及黏膜下層腺體肥大、增生程度及黏膜上皮完整性，并進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，模型組顯示病理評(píng)分高于空白組(P<0.05)，孟魯司特鈉組、鼻敏通竅方中劑量組小鼠病理評(píng)分低于模型組(P<0.05)。

注：與空白組比較， #P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

表2 鼻黏膜組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

3.2.2 鼻黏膜組織HE染色及EOS計(jì)數(shù) 與空白組比較，模型組小鼠鼻黏膜纖毛柱狀上皮細(xì)胞排列紊亂，缺乏完整性，纖毛大量脫落，固有層腺體增生明顯，并伴有大量炎性細(xì)胞的滲出；與模型組比較，鼻敏通竅方組小鼠纖毛柱狀上皮細(xì)胞排列整齊，偶有脫落，有少量炎性滲出，而孟魯司特鈉組小鼠可見(jiàn)上皮細(xì)胞脫落，腺體增生，有少量炎性滲出，見(jiàn)圖3A。隨機(jī)選取3個(gè)不同視野(HE，×400)觀察，發(fā)現(xiàn)模型組EOS計(jì)數(shù)高于空白組(P<0.05)；孟魯司特鈉組、鼻敏通竅方組EOS計(jì)數(shù)低于模型組(P<0.05)，見(jiàn)圖3B。

注：黃色箭頭處為大量性細(xì)胞浸潤(rùn)，紅色箭頭處為固有層腺體增生，黑色箭頭處為上皮細(xì)胞脫落。與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.3 小鼠外周血IgE表達(dá) 模型組小鼠IgE表達(dá)高于空白組(P<0.05)，孟魯司特鈉組、鼻敏通竅方組小鼠IgE表達(dá)低于模型組(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.4 小鼠PBMC中EOS比例 模型組小鼠EOS比例高于空白組(P<0.05)，鼻敏通竅方組小鼠EOS比例低于模型組(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

4 討論

變應(yīng)性鼻炎是兒童最常見(jiàn)的過(guò)敏性疾病之一。主要由IgE介導(dǎo)，即特應(yīng)性個(gè)體吸入過(guò)敏原后，過(guò)激產(chǎn)生IgE抗體，與各類免疫細(xì)胞如EOS、肥大細(xì)胞等表面抗體結(jié)合，使免疫細(xì)胞過(guò)度活化，致機(jī)體處于致敏狀態(tài)，釋放多種炎性介質(zhì)，而導(dǎo)致鼻黏膜非感染性慢性炎性浸潤(rùn)[6]。多年相關(guān)研究證實(shí)IgE是過(guò)敏反應(yīng)的核心介導(dǎo)，總IgE增加已經(jīng)成為AR主要的診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療靶標(biāo)[9]。

AR是一種以Th2過(guò)度分化為主的鼻黏膜免疫疾病，Th2細(xì)胞因子的過(guò)量產(chǎn)生和鼻黏膜組織中與過(guò)敏相關(guān)促炎細(xì)胞的大量浸潤(rùn)，導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能異常[10]。AR存在速發(fā)相和遲發(fā)相反應(yīng)，鼻塞在兩者中都是顯著的癥狀[11]。鼻腔黏膜在過(guò)敏原反復(fù)刺激下，肥大細(xì)胞和EOS等炎性細(xì)胞聚集鼻腔，導(dǎo)致黏膜腫脹[12]。EOS在變應(yīng)性鼻炎的生理病理中起著重要的作用[13]，是人類過(guò)敏性疾病中重要的效應(yīng)細(xì)胞，可釋放促炎介質(zhì)，在過(guò)敏性鼻炎患者的血常規(guī)中，EOS數(shù)量升高[14]。鼻黏膜EOS積累是導(dǎo)致鼻腔黏膜慢性持續(xù)炎癥的重要因素。近年研究發(fā)現(xiàn)，EOS是一種多功能的白細(xì)胞，它參與維持組織的動(dòng)態(tài)平衡、調(diào)節(jié)針對(duì)特定微生物的適應(yīng)性和固有免疫應(yīng)答[15]。變應(yīng)性疾病的抗原呈遞細(xì)胞不僅激活Th2細(xì)胞，也分泌促炎癥反應(yīng)介質(zhì)，這些因子可誘發(fā)上皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子吸引EOS[16]。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)很早就已經(jīng)認(rèn)識(shí)到AR的發(fā)病與自然環(huán)境、氣候、人體存在密切的關(guān)系，中醫(yī)認(rèn)為小兒鼻鼽的發(fā)病，除冒受外風(fēng)、異氣，伏風(fēng)內(nèi)潛之外，還與患兒肺、脾、腎三臟功能失調(diào)密切相關(guān)[17]。其病理因素主要為風(fēng)和痰。小兒肺常不足，氣候交替，環(huán)境改變之時(shí)，異稟質(zhì)小兒因風(fēng)邪侵襲而肺失宣降，津液失布；小兒脾常不足，易聚濕為痰；小兒腎常不足，痰根難祛，而致風(fēng)痰博結(jié)，阻礙津液正常運(yùn)化，使其發(fā)生代謝異常，因此出現(xiàn)鼻癢，噴嚏，流涕，鼻塞反復(fù)發(fā)作無(wú)常。鼻敏通竅方主要由蒼耳子、辛夷、川芎、白芷、防風(fēng)、白芍、烏梅、生石膏組成。方中蒼耳子、辛夷、白芷有辛陽(yáng)發(fā)散、宣風(fēng)通竅之功；川芎辛溫香竄，活血行氣，祛風(fēng)止痛，可除久病留瘀，祛風(fēng)同時(shí)配伍活血之藥，取“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”之意，以利風(fēng)邪消散；白芍、烏梅能滋陰和營(yíng)，斂津澀涕，又防辛溫之藥發(fā)散太過(guò)而耗傷小兒氣津；防風(fēng)為風(fēng)中潤(rùn)劑，性甘潤(rùn)，既能祛風(fēng)發(fā)表止癢，宣肺氣，又有升陽(yáng)運(yùn)脾化痰之功，與烏梅組成藥對(duì)，祛風(fēng)抗過(guò)敏[18]，甘酸斂肺生津，可順接臟腑陰陽(yáng)之氣；生石膏清肺之郁熱。全方祛風(fēng)行氣化痰，驅(qū)邪不傷津，斂液不留邪，平衡小兒陰陽(yáng)。全方配伍根據(jù)小兒用藥特點(diǎn)，遵從中醫(yī)整體觀念和辨證施治原則，謹(jǐn)守病機(jī)，標(biāo)本兼顧，共奏祛風(fēng)化痰通竅之效，在臨床上獲得了持久而顯著的療效。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，變應(yīng)性鼻炎小鼠模型體內(nèi)IgE維持高水平狀態(tài)，而循環(huán)EOS也呈現(xiàn)高表達(dá)；變應(yīng)性鼻炎模型組小鼠鼻黏膜纖毛柱狀上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，而鼻敏通竅方組小鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞有所改善。這些結(jié)果表明，小兒變應(yīng)性鼻炎慢性炎癥持續(xù)存在，鼻敏通竅方能夠下調(diào)IgE的合成，減少EOS的浸潤(rùn)，維護(hù)鼻黏膜纖毛柱狀上皮細(xì)胞的完整性，而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，改善鼻部慢性炎癥，減輕變應(yīng)性鼻炎的發(fā)作?；诒敬螌?shí)驗(yàn)結(jié)果，下一步擬采用分子生物學(xué)技術(shù)，從EOS過(guò)度活化的角度出發(fā)，篩選出能影響EOS活化的趨化因子，進(jìn)一步揭示鼻敏通竅方對(duì)兒童變應(yīng)性鼻炎治療的作用機(jī)理，開(kāi)拓中醫(yī)藥防治小兒變應(yīng)性鼻炎的新思路。