劉盈盈， 許顯莉， 馮海生， 李彩霞*， 馬世震*

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2.青海省青藏高原特色生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

桃兒七為小檗科植物桃兒七Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying的干燥根及根莖[1-5]，主要分布在我國青海、西藏、四川、陜西、甘肅等地，具有祛風(fēng)除濕、活血止痛、祛痰止咳之功效[6-7]?，F(xiàn)代藥理研究還表明，桃兒七具有抗腫瘤、祛痰止咳、抗炎、抗病毒等作用[8-12]。桃兒七主要含有鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素等木脂素類化合物和槲皮素、山柰酚等黃酮類化合物，其中鬼臼毒素為主要活性成分，同時，鬼臼毒素是用于治療各種惡性腫瘤抗癌藥物依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)的化學(xué)合成原料藥[13-15]，研究發(fā)現(xiàn)，4′-去甲基鬼臼毒素對羊膜細(xì)胞培養(yǎng)的皰疹病毒有良好的抑制作用，此外，桃兒七中槲皮素和山柰酚等成分對鎮(zhèn)咳祛痰顯著效果。因此，桃兒七藥材應(yīng)用廣泛，全面有效控制桃兒七藥材質(zhì)量具有重要意義。

目前，桃兒七藥材尚無國家標(biāo)準(zhǔn)及地方標(biāo)準(zhǔn)。僅小檗科植物桃兒七Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying的干燥成熟果實(shí)在《中國藥典》中以“小葉蓮”之名收載，對其性狀、顯微特征進(jìn)行了描述，采用TLC對鬼臼毒素進(jìn)行了定性鑒別，規(guī)定了水分、總灰分含量限度[16]。張麗等[17]對10批桃兒七藥材進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，對其植物形態(tài)、性狀、顯微特征進(jìn)行描述，采用TLC法進(jìn)行定性鑒別以及對4′-去甲基鬼臼毒素、山柰酚、鬼臼毒素3種成分進(jìn)行含量測定。對桃兒七藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，尚未包括雜質(zhì)、水分、總灰分、醇溶性浸出物含量等其他常規(guī)檢查項(xiàng)，也未包含農(nóng)藥殘留量、重金屬及有害元素等安全性內(nèi)容。近年來，中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)安全性方面內(nèi)容受到較大關(guān)注，2020年版《中國藥典》主要特點(diǎn)之一就是提高藥品安全和有效控制要求，進(jìn)一步加強(qiáng)對藥材飲片重金屬及有害元素、禁用農(nóng)藥殘留、真菌毒素以及內(nèi)源性有毒成分的控制[16]。因此，現(xiàn)有桃兒七質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究不能有效地控制桃兒七藥材整體質(zhì)量，還需進(jìn)一步完善，補(bǔ)充安全檢查項(xiàng)目。

本研究采用顯微鑒別方法和薄層色譜法(TLC)對桃兒七藥材進(jìn)行鑒別，同時按2020年版《中國藥典》(四部)方法對其雜質(zhì)、水分、總灰分、酸不溶性灰分、重金屬、農(nóng)藥殘余量、醇溶性浸出物等進(jìn)行考察；采用HPLC法對4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚、鬼臼毒素4種成分進(jìn)行定量分析，以期制定桃兒七藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，為有效地控制桃兒七藥材整體質(zhì)量提供科學(xué)參考。

1 材料

1.1 藥材 桃兒七經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所馬世震研究員鑒定為正品，樣本存放于中國科學(xué)院西北高原生物研究所藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。具體信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 儀器與試劑 SL-500A高速萬能粉碎機(jī)(浙江省永康市松青五金廠)；ML2047電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；BPG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱(一恒科學(xué)儀器有限公司)；SK3310LHC超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；N-1210BV-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；熒光顯微鏡尼康CI-S(日本尼康公司)；Molatom 18220DXG超純水系統(tǒng)(重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司)；高效GF254預(yù)制薄層板(青島海洋化工廠)；硅膠HF254預(yù)制薄層板(煙臺化工廠)。鬼臼毒素對照品(純度≥98%)(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；4′-去甲基鬼臼毒素對照品(純度≥99.2%，中國食品藥品檢定研究院)；山柰酚對照品(純度≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；槲皮素對照品(純度≥98%，北京中科質(zhì)檢生物有限公司)。甲酸(色譜純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)；甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)；二氯甲烷(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；乙酸乙酯(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；硫酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；香草醛(西隴科學(xué)股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 基源鑒別 通過野外標(biāo)本采集，并借鑒《中國植物志》[18]進(jìn)行描述。桃兒七是小檗科桃兒七屬多年生草本，植株高20～50 cm；根狀莖粗短，節(jié)狀，多須根；莖直立，單生，具縱棱，無毛，基部被褐色大鱗片；葉2枚，薄紙質(zhì)，非盾狀，基部心形，3～5深裂幾達(dá)中部，裂片不裂或有時2～3小裂，裂片先端急尖或漸尖，上面無毛，背面被柔毛，邊緣具粗鋸齒；葉柄長10～25 cm，具縱棱，無毛；花大，單生，先葉開放，兩性，整齊，粉紅色；萼片6，早萎。花瓣6，倒卵形或倒卵狀長圓形，長2.5～3.5 cm，寬1.5～1.8 cm，先端略呈波狀；雄蕊6，長約1.5 cm，花絲較花藥稍短，花藥線形，縱裂，先端圓鈍，藥隔不延伸；雌蕊1，長約1.2 cm，子房橢圓形，1室，側(cè)膜胎座，含多數(shù)胚胎，花柱短，柱頭頭狀；漿果卵圓形，長4～7 cm，直徑2.5～4 cm，熟時桔紅色；種子卵狀三角形，紅褐色，無肉質(zhì)假種皮；花期5～6月，果期7～9月；以根及根狀莖入藥；秋季采挖，洗凈曬干。

2.2 性狀鑒別 通過野外標(biāo)本采集，并借鑒《中國植物志》[18]進(jìn)行描述。桃兒七根莖呈不規(guī)則結(jié)節(jié)狀，長0.5～3 cm，直徑0.5～1 cm，表面灰黃色、暗灰棕色或淡褐色，上面具數(shù)個稍膨大而凹窩不甚明顯的莖基，旁邊有一淡棕色干燥苞芽；質(zhì)硬，折斷面略平坦，淡黃棕色，隱約有一圈維管束小點(diǎn)；根密生，細(xì)長圓柱形，較順直，長2.3～46 cm，直徑1.2～4.0 mm,表面淡棕色至棕黃色，較光滑或具細(xì)縱皺紋和細(xì)根；質(zhì)脆，易折斷，斷面黃白色，粉性，中心有一淡黃色小點(diǎn)；氣微，味苦、微辛。

2.3 顯微鑒別 取桃兒七粉末少許，置載玻片上，水合氯醛制片，于顯微鏡下觀察，見圖1。由此可知，本品淀粉粒眾多，單粒類圓形，復(fù)粒由2～4分粒組成，少數(shù)5～9分粒；導(dǎo)管數(shù)個相聚或單個散在，大多為網(wǎng)紋，少數(shù)為孔紋、梯紋、螺紋。

注：A～F分別為淀粉粒、環(huán)紋導(dǎo)管、孔紋導(dǎo)管、梯紋導(dǎo)管、網(wǎng)紋導(dǎo)管、維束管。

2.4 薄層色譜鑒別 取藥材粉末1 g，加入40 mL甲醇超聲提取21 min，放冷，搖勻，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加5 mL甲醇溶解，即得供試品溶液。

精密稱取鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg該成分的溶液，即得對照品溶液。

參照2020年版《中國藥典》(四部)通則0502，吸取上述供試品及4種對照品溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水-甲酸(15∶1.2∶0.1∶0.1)為展開劑，在展開缸中預(yù)飽和30 min后展開，取出，在105 ℃下烘干，254 nm紫外光檢視，見圖2。

注：1～10為不同產(chǎn)地桃兒七，11為4′-去甲基鬼臼毒素對照品，12為鬼臼毒素對照品，13為槲皮素對照品，14為山柰酚對照品。

2.5 檢查

2.5.1 雜質(zhì) 按照2020年版《中國藥典》(四部)通則2301項(xiàng)測定，結(jié)果見表2，可知10批藥材雜質(zhì)范圍為1.19%～4.98%，平均為3.13%。因此，暫將雜質(zhì)限度定為不得超過4.00%。

2.5.2 水分 按照2020年版《中國藥典》(四部)通則0832項(xiàng)第二法測定，取供試品粉末2～5 g，平鋪于干燥至恒定質(zhì)量的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，疏松品不超過10 mm，精密稱定質(zhì)量，開啟瓶蓋，在100～105 ℃下干燥5 h，瓶蓋蓋好，移到干燥器中，放冷30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，放冷，稱定質(zhì)量，至連續(xù)2次質(zhì)量差異不超過5 mg為止，根據(jù)減失的質(zhì)量計算含水量，結(jié)果見表2，可知10批藥材水分范圍為5.28%～8.46%，平均為7.24%。以平均值的變差系數(shù)20%核算，確定水分不得超過9.00%。

2.5.3 灰分 按照2020年版《中國藥典》(四部)通則2302項(xiàng)第二法測定，取供試品粉末3～5 g，置熾灼至恒定質(zhì)量的坩堝中，稱定質(zhì)量(準(zhǔn)確至0.01 g)，緩緩熾熱，注意避免燃燒，至完全炭化時逐漸升高溫度至500～600 ℃，使完全灰化并恒定質(zhì)量，根據(jù)殘渣質(zhì)量計算總灰分含量。取所得灰分，在坩堝中小心加入稀鹽酸約10 mL，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上加熱10 min，表面皿用熱水5 mL沖洗，洗液并入坩堝中，用無灰濾紙過濾，坩堝內(nèi)的殘渣用水洗于濾紙上，并洗滌至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣與濾紙移到同一坩堝中，干燥，熾灼至恒定質(zhì)量，根據(jù)殘渣質(zhì)量計算酸不溶性灰分的含量，結(jié)果見表2，可知10批藥材總灰分含量范圍為2.20%～4.50%，平均為3.57%；酸不溶性灰分含量范圍為0.25%～1.96%，平均為0.89%。以平均值的變差系數(shù)20%核算，擬定總灰分含量不得超出4.00%，酸不溶性灰分含量不得超過1.00%。

表2 雜質(zhì)、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量測定結(jié)果

2.5.4 重金屬及有害元素 2020年版《中國藥典》(四部)通則2321項(xiàng)下規(guī)定了鉛、鎘、砷、汞、銅檢測方法，故選定此5種重金屬進(jìn)行含量測定。采用原子吸收分光光度法，鉛、鎘均采用石墨爐法進(jìn)行測定，砷采用氫化物法進(jìn)行測定，汞采用冷蒸汽吸收法進(jìn)行測定，銅采用火焰法進(jìn)行測定，結(jié)果見表3,可知10批藥材鉛含量為0.24～1.16 mg/kg，鎘含量為0.011～0.054 mg/kg，砷含量為0.077～0.53 mg/kg，汞含量為0.000 9～0.005 5 mg/kg，銅含量為5.33～14.53 mg/kg，平均值分別為0.69、0.037、0.247、0.002 7、8.17 mg/kg。2020年版《中國藥典》(四部)規(guī)定，鉛不得超過5 mg/kg，鎘不得超過1 mg/kg，砷不得超過2 mg/kg，汞不得超過0.2 mg/kg，銅不得超過20 mg/kg，本實(shí)驗(yàn)10批藥材五者含量均在上述范圍內(nèi)。

表3 重金屬及有害元素含量測定結(jié)果

2.5.5 農(nóng)藥殘留量 由于桃兒七病蟲害主要是蚜蟲和田鼠[19]，故選取常用于防治蚜蟲的農(nóng)藥馬拉硫磷、殺螟硫磷、抗蚜威、溴氰菊酯、甲氰菊酯進(jìn)行農(nóng)藥殘留量測定。按照2020年版《中國藥典》(四部)通則2341項(xiàng)下方法檢測，結(jié)果5種農(nóng)藥均未檢出。2020年版《中國藥典》(四部)通則2321項(xiàng)下規(guī)定，農(nóng)藥殘留量不得超過0.01 mg/kg，故擬定桃兒七5種農(nóng)藥殘留量亦然。

2.6 浸出物檢查 取10批藥材粉末適量，精密稱定，按2020年版《中國藥典》(四部)通則2201項(xiàng)下醇溶性浸出物測定法(熱浸法)測定，結(jié)果見表2，可知10批藥材醇溶性浸出物含量為4.04%～10.99%，平均為6.34%，以平均值的變差系數(shù)20%核算，擬定浸出物含量不得少于5.00%。

2.7 含量測定

2.7.1 色譜條件 JADE-PAK ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.04%甲酸(B)，梯度洗脫(0～5 min,5%～25%A；5～15 min，25%～28%A；15～30 min，28%A；30～40 min，28%～45%A；40～60 min，45%～70%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量10 μL。在該條件下各色譜峰分離情況良好，見圖3。

1.4′-去甲基鬼臼毒素 2.槲皮素 3.山柰酚 4.鬼臼毒素

2.7.2 對照品溶液制備 精密稱取鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、山柰酚、槲皮素對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1、0.5、0.1、0.1 mg/mL的溶液，即得。

2.7.3 供試品溶液制備 精密稱取藥材干燥粉末0.1 g，過40目篩，置于具塞試管中，在料液比1∶40、超聲時間21 min、超聲溫度56 ℃、82%甲醇下提取，共3次，抽濾得提取液，定容至25 mL量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.7.4 線性關(guān)系考察 吸取“2.7.2”項(xiàng)下對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣2、4、6、8、10、12、14、16 μL。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表4，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表4 各成分線性關(guān)系

2.7.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.7.2”項(xiàng)下對照品溶液10 μL，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣5次，測得4種成分峰面積RSD分別為0.20%、0.39%、0.26%、0.21%，表明儀器精密度良好。

2.7.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材(S1)6份，每份約0.1 g，精密稱定，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得4種成分含量RSD分別為1.07%、2.00%、1.86%、3.00%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批藥材(S1)約0.1 g，精密稱定，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、 12、24 h在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得4種成分峰面積RSD分別為0.52%、0.96%、0.86%、0.42%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的藥材(S1)9份，每份約0.1 g，精密稱定，按樣品含量-對照品量1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例分別加入各對照品溶液，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計算回收率，結(jié)果見表5。

表5 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.7.9 樣品含量測定 取10批藥材提取物，平行3組，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計算含量，結(jié)果見表6。由此可知，4種成分含量差異較大，可能是受植物生長環(huán)境及采集時間的影響；鬼臼毒素含量最高，故以其為指標(biāo)成分，擬定含量不得少于2.80 mg/g。

表6 各成分含量測定結(jié)果(mg/g)

3 討論

3.1 TLC條件篩選 《中國藥典》中小葉蓮TLC鑒別方法采用環(huán)己烷-水飽和的正丁醇-甲酸(6.5∶2.5∶0.8)的上層溶液為展開劑，但只針對一種成分。張麗等[17]采用氯仿-甲醇(15∶1)下層液為展開劑展開，也只針對3種成分。本實(shí)驗(yàn)比較了不同的展開劑系統(tǒng)、不同點(diǎn)樣量、不同檢視方法下的色譜，同時，采用3個不同廠家的薄層板對此方法的耐用性進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)在不同的薄層板上4種成分的斑點(diǎn)均可達(dá)到有效分離，表明該方法耐用性強(qiáng)。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，最終確定TLC展開條件。

3.2 浸出物測定方法考察 本實(shí)驗(yàn)先采用冷浸法，分別使用8種不同溶劑測定桃兒七浸出物含量，發(fā)現(xiàn)使用50%乙醇浸出物含量最高。然后，將50%乙醇作為溶劑，對比熱浸法和冷浸法不同方法下桃兒七浸出物含量，發(fā)現(xiàn)熱浸法條件下浸出物含量較高。因此，選擇熱浸法，并以50%乙醇作為溶劑，對10批桃兒七進(jìn)行浸出物含量測定。

3.3 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚和鬼臼毒素的最大吸收波長均不同，因此，比較不同波長下的色譜圖，為最大可能的兼顧4種成分的峰形及靈敏度，試驗(yàn)最終選擇254 nm為檢測波長[20]。選擇了不同比例及組合的流動相，通過比較色譜圖中各成分峰形情況，最終確定乙腈-0.04%甲酸水為流動相，梯度洗脫，這一與葉耀輝等[21]的研究結(jié)果一致。

3.4 含量限度確定 本研究中，鬼臼毒素含量2.881～62.548 mg/g，平均值25.768 mg/g，含量差異較大，這可能是由于藥材的不同生長年限及不同的生長發(fā)育環(huán)境[22]。李運(yùn)等[23]在甘肅產(chǎn)馬尾連藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，由于馬尾連中鹽酸小檗堿含量范圍差異較大，故以最低鹽酸小檗堿含量設(shè)為含量限度。因此，本實(shí)驗(yàn)也以鬼臼毒素最低測定值為含量限度，即不得少于2.80 mg/g。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了桃兒七藥材中4種成分的TLC鑒別方法，方法簡便易行，結(jié)果可靠，并對10批不同產(chǎn)地的桃兒七藥材進(jìn)行了雜質(zhì)、水分、總灰分、酸不溶性灰分、重金屬及有害元素、農(nóng)藥殘留量、醇溶性浸出物檢測及4種成分含量測定，初步完成了桃兒七的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，以期為科學(xué)制定桃兒七的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供借鑒，利于有效控制桃兒七藥材品質(zhì)。