周敬凱， 翁競(jìng)玉， 朱 盼， 李 麗

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001)

地菍別名地稔、鋪地稔等，為野牡丹科植物地菍MelastomadodecandrumLour.的全草，分布于長(zhǎng)江以南的廣西等省區(qū)，資源豐富，是廣西民間常用草藥，其味甘、微澀，性微涼，具有清熱解毒、活血止血等功效。課題組前期發(fā)現(xiàn)[1-6]，地菍提取液能調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥小鼠的血脂紊亂現(xiàn)象，而對(duì)正常小鼠空腹血糖無(wú)影響，并且對(duì)糖尿病大、小鼠模型均有體質(zhì)量減輕的作用，具有潛在的抑制肥胖作用，但目前還未見(jiàn)關(guān)于地菍總黃酮對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠的干預(yù)作用及機(jī)制報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)參考《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》，在給予高熱量、高脂食物誘發(fā)大鼠肥胖的同時(shí)以地菍總黃酮干預(yù)，考察體質(zhì)量、血脂等生理生化指標(biāo)改變，同時(shí)考察該成分對(duì)肥胖大鼠腸道菌群的影響，為將其開(kāi)發(fā)成減肥降脂產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，85只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002。

1.2 藥材及飼料 地菍購(gòu)自南寧小瑤王藥店，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物教研室的梁子寧教授鑒定為地菍MelastomadodecandrumLour.的干燥全草。按照黃馨慧等[7]報(bào)道的方法，藥材粉碎后用50%乙醇提取，濾液減壓濃縮后經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化，蒸干后得到粉末備用，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.3%。普通飼料由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供；高脂飼料參考《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》，由實(shí)驗(yàn)室自行制作，配方為蔗糖15%、豬油15%、蛋白粉10%、膽固醇1%、膽酸鈉0.2%、基礎(chǔ)飼料58.8%。

1.3 試劑及儀器 奧利司他片購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限公司?？偰懝檀?total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low desity lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high desity lipoprotein cholesterol，HDL-C)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。RE-501型升降恒溫水浴鍋(上海予華儀器設(shè)備有限公司)；CCA-20型低溫冷卻水循環(huán)泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；Infinite M200PRO型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；UV-1901雙束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；5415D型冷凍低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；XP cycler型PCR儀(杭州博日科技有限公司)；Hiseq型高通量測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)。

1.4 分組與給藥 以85只SPF級(jí)SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)分成空白組(10只)及誘導(dǎo)組(75只)，空白組大鼠給予普通飼料，誘導(dǎo)組大鼠給予高脂飼料。喂養(yǎng)2周后淘汰25只肥胖抵抗大鼠，其余隨機(jī)分為模型組(高脂飼料)、奧利司他組(高脂飼料+60 mg/kg奧利司他)、地菍總黃酮高劑量組(高脂飼料+750 mg/kg地菍總黃酮)、地菍總黃酮中劑量組(高脂飼料+500 mg/kg地菍總黃酮)、地菍總黃酮低劑量組(高脂飼料+330 mg/kg地菍總黃酮)，連續(xù)給藥6周，空白組及模型組給予相同容量的蒸餾水。

1.5 樣本采集 給藥6周后，隨機(jī)采集空白組、模型組及地菍總黃酮高劑量組大鼠糞便(n=6)，置于-80 ℃冰箱中保存，用于腸道菌群的檢測(cè)；麻醉后稱量各組大鼠體質(zhì)量，測(cè)量體長(zhǎng)后腹主動(dòng)脈取血，血樣樣本離心收集血清，置于-80 ℃冰箱中冷凍保存，用于生化指標(biāo)的檢測(cè)；收集大鼠雙腎周?chē)案讲G周?chē)咨荆糜谥鞠禂?shù)的測(cè)定。

1.6 指標(biāo)測(cè)定

1.6.2 脂肪系數(shù) 分離大鼠雙腎及附睪周?chē)陌咨窘M織，稱定質(zhì)量后計(jì)算脂肪系數(shù)，公式為脂肪系數(shù)=(m1/m)×100%(m1為大鼠雙腎及附睪周?chē)咨窘M織質(zhì)量，m為大鼠體質(zhì)量)。

1.6.3 血清生化指標(biāo) 包括TG、TC、LDL-C、HDL-C水平，按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行測(cè)定。

1.6.4 糞便DNA提取和測(cè)序 采用 SDS 裂解液凍融法對(duì)空白組、模型組、地菍總黃酮高劑量組進(jìn)行 DNA 提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和濃度，采用正向引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增。Barcode 采用特定的 7-bp 特定序列合成到序列中，將PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增、純化、量化后，采用Hiseq高通量測(cè)序儀測(cè)序。

1.6.5 生物信息學(xué)分析 根據(jù)Barcode序列和引物序列從原始數(shù)據(jù)中拆分各個(gè)樣本的數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用Vsearch v2.4.4軟件對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，除去序列小于150 bp、平均質(zhì)量值低于20、含有不明確堿基的序列、含有>8 bp的單核苷酸重復(fù)序列，得到最終有效序列(effective tags)。OTU分析使用 Vsearch v2.4.4軟件分析，以97%相似度將序列聚類(lèi)成操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units，OUT)，通過(guò)VSEARCH 基于 SILVA128數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)代表序列進(jìn)行物種注釋，進(jìn)行OUT水平Alpha多樣性指數(shù)計(jì)算及不同組間菌群組成的相似性。

2 結(jié)果

2.1 地菍總黃酮對(duì)高脂飲食大鼠體質(zhì)量增重、Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)的影響 由表1可知，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)及雙腎、附睪周?chē)鞠禂?shù)升高(P<0.01)，說(shuō)明模型建立成功；與模型組比較，奧利司他組和地菍總黃酮高、中、低劑量組大鼠體質(zhì)量及雙腎、附睪脂肪系數(shù)均降低(P<0.01)；奧利司他組、地菍總黃酮高劑量組大鼠Lee’s指數(shù)降低(P<0.01)。

表1 地菍總黃酮對(duì)高脂飲食大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)的影響

2.2 地菍總黃酮對(duì)大鼠血脂的影響 由表2可知，與空白組比較，模型組大鼠TC、TG水平升高(P<0.01)，HDL-C水平降低(P<0.01)，說(shuō)明長(zhǎng)期的高脂飲食誘導(dǎo)造成了大鼠血脂紊亂；與模型組比較，奧利司他組大鼠TC水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)；地菍總黃酮高劑量組大鼠TC、TG水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.01)；地菍總黃酮中劑量組大鼠TG水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)。

表2 地菍總黃酮對(duì)高脂飲食大鼠血脂的影響

2.3 地菍總黃酮對(duì)大鼠腸道菌群的影響

2.3.1 平均有效序列、平均操作單元、平均覆蓋度 由表3可知，空白組糞便菌群平均有效序列為132 370條，經(jīng)97%相似性歸并后得到平均操作單元(OTUs)821個(gè)，平均測(cè)序覆蓋深度(coverage指數(shù))0.998 9；模型組獲得平均有效序列131 568條，經(jīng)97%相似性歸并后得到平均OTUs為576個(gè)，平均測(cè)序覆蓋指數(shù)為0.999；地菍總黃酮高劑量組糞便菌群獲得平均有效序列127 318條，經(jīng)97%相似性歸并后得到平均OTUs數(shù)707個(gè)，平均測(cè)序覆蓋深度為0.998 9。各組平均有效序列均高達(dá)12萬(wàn)條以上，說(shuō)明樣本滿足測(cè)序要求；各組平均測(cè)序深度均在0.998以上，說(shuō)明樣品中序列未被測(cè)到的概率較低；空白組、模型組及地菍總黃酮高劑量組之間OTUs雖無(wú)差異，但與模型組比較，地菍總黃酮干預(yù)后有所增加，說(shuō)明地菍總黃酮有提高高脂飲食大鼠菌群物種多樣性的趨勢(shì)。

表3 地菍總黃酮對(duì)大鼠腸道菌群平均有效序列、平均操作單元、平均覆蓋度的影響

2.3.2 OTU組成相似性 圖1顯示，空白組、模型組、地菍總黃酮高劑量組OTUs數(shù)目分別為1 928、1 527、1 599，其中996個(gè)OTUs為3組所共有；3組均檢出其特異的OTUs，分別為432、179、99；空白組與模型組共有的OTU數(shù)目為174，空白組與地菍總黃酮高劑量組共有的OTUs數(shù)目為326，表明地菍總黃酮提高了高脂飲食大鼠腸道菌群的多樣性，同時(shí)也增加了高脂飲食大鼠與空白組 OTU 組成的相似性。

注：A為空白組，B為地菍總黃酮高劑量組，C為模型組。

2.3.3 Alpha多樣性 由表4可知，空白組、模型組、地菍總黃酮高劑量組Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均無(wú)明顯差異(P>0.05)；與模型組比較，地菍總黃酮高劑量組的Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)均有升高趨勢(shì)，而且逐漸向空白組接近，提示地菍總黃酮有提高高脂飲食大鼠腸道菌群Alpha多樣性的趨勢(shì)。

表4 地菍總黃酮對(duì)大鼠腸道菌群Alpha多樣性分析

2.3.4 地菍總黃酮對(duì)大鼠腸道菌群門(mén)水平的影響 由表5可知，與空白組比較，模型組厚壁菌門(mén)(Firmicutes)相對(duì)豐度升高(P<0.05)，擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)相對(duì)豐度降低(P<0.01)；與模型組比較，地菍總黃酮高劑量組擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)相對(duì)豐度升高(P<0.01)，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)相對(duì)豐度降低(P<0.01)。

表5 各組大鼠糞便在門(mén)水平上的相對(duì)豐度

2.3.5 地菍總黃酮對(duì)大鼠腸道菌群屬水平的影響 由表6可知，與空白組比較，模型組摩根氏菌屬(Morganella)、支原體菌屬(Allobaculum)、柯林斯氏菌屬相對(duì)豐度升高(P<0.05，P<0.01)，考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、普雷沃茨菌屬(Prevotella)、CF231菌屬相對(duì)豐度降低(P<0.05)；與模型組比較，地菍總黃酮高劑量組變形桿菌屬(Proteus)、羅斯氏菌屬(Roseburia)、CF231菌屬、普雷沃茨菌屬(Prevotella)相對(duì)豐度升高(P<0.05，P<0.01)，摩根氏菌屬(Morganella)相對(duì)豐度降低(P<0.01)。

表6 各組大鼠糞便在屬水平上的相對(duì)豐度

3 討論

長(zhǎng)期高脂飲食是引起肥胖、糖尿病、高血壓、動(dòng)脈硬化等疾病的重要危險(xiǎn)因素之一[8-9]。體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)是反映動(dòng)物肥胖程度的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)地菍總黃酮能有效抑制高脂飲食誘導(dǎo)SD大鼠的體質(zhì)量增加，降低Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)，證實(shí)地菍總黃酮能有效抑制高脂飲食的轉(zhuǎn)化與吸收，從而控制體質(zhì)量增長(zhǎng)。血脂紊亂是肥胖患者常見(jiàn)的代謝標(biāo)志之一，血脂水平能夠反映全身性的脂質(zhì)代謝狀態(tài)[10-11]。由于現(xiàn)代人們對(duì)高脂飲食的習(xí)慣，飲食中攝入大量膽固醇及脂肪，體內(nèi)的游離脂肪酸增多，積聚的甘油三酯也逐漸增多，進(jìn)而導(dǎo)致血脂異常。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)地菍總黃酮能有效降低大鼠血清中TG和TC水平，提高HDL-C水平，LDL-C也有一定程度的改善作用，提示地菍總黃酮對(duì)高脂飲食大鼠具有降血脂的作用。

腸道菌群多樣性是促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持機(jī)體免疫和新陳代謝的基礎(chǔ)，高脂飲食會(huì)導(dǎo)致腸道菌群多樣性減少，膜完整性改變，導(dǎo)致通透性增加和脂多糖移位增加，免疫系統(tǒng)發(fā)生變化，產(chǎn)生炎癥[12]。長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)降低腸道菌群的多樣性，本實(shí)驗(yàn)初步探究地菍總黃酮對(duì)腸道菌群Alpha多樣性及結(jié)構(gòu)的影響，與空白組比較，模型組OTU數(shù)降低、腸道菌群Alpha多樣性降低；與模型組比較，地菍總黃酮高劑量組OTU數(shù)升高、腸道菌群多樣性升高。有研究表明，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的水平和比例與宿主的身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)有關(guān)[13]。Ley等[14]發(fā)現(xiàn)，肥胖人群厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比值高于體質(zhì)量正常人群，這與本研究結(jié)果相符，經(jīng)過(guò)給予地菍總黃酮進(jìn)行干預(yù)，高脂飲食大鼠擬桿菌門(mén)豐度升高，厚壁菌門(mén)豐度降低，厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比值降低，且體質(zhì)量降低。摩根氏菌屬(Morganella)是一種條件致病菌，體內(nèi)過(guò)多會(huì)使菌群比例失衡，發(fā)生泌尿感染等疾病[15]。普雷沃茨菌屬(Prevotella)能降解食物中的碳水化合物和多糖，并能參與合成多種維生素，有學(xué)者認(rèn)為該菌種能產(chǎn)生對(duì)維持人體健康具有多種重要作用的短鏈脂肪酸(SCFA)，抑制條件致病菌，保護(hù)宿主免受炎癥和非感染性結(jié)腸疾病的侵害[16]。也有研究發(fā)現(xiàn)[17]，高脂肪飲食所導(dǎo)致的超重或肥胖兒童體內(nèi)普雷沃茨菌屬的豐度降低?？祭瓧U菌屬(Phascolarctobacterium)能產(chǎn)生短鏈脂肪酸，對(duì)維持人體健康具有多種重要作用，如增強(qiáng)胃腸道機(jī)能、降低炎癥水平等，據(jù)報(bào)道其相對(duì)水平與人類(lèi)的積極樂(lè)觀的情緒有關(guān)[18]。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)給予地菍總黃酮，增加了高脂飲食大鼠的腸道多樣性，上調(diào)了擬桿菌門(mén)、考拉桿菌屬及普雷沃茨菌屬等潛在有益菌的相對(duì)豐度，下調(diào)厚壁菌門(mén)及摩根氏菌屬等條件致病菌的相對(duì)豐度，這可能與地菍總黃酮影響腸道菌群，提高腸道菌群多樣性，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，抑制腸道內(nèi)毒素進(jìn)入血液誘發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮降脂減重的作用機(jī)制有關(guān)。但由于體內(nèi)腸道菌群是一個(gè)大整體，細(xì)菌菌群相互促進(jìn)、相互制約的關(guān)系，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示地菍總黃酮能降低高脂飲食大鼠體質(zhì)量及增重，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)血脂紊亂有關(guān)；同時(shí)本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)，初步探究了地菍總黃酮對(duì)高脂飲食大鼠腸道菌群的影響，推測(cè)其作用機(jī)制可能同降低厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比值、降低條件致病菌、提高腸道菌群多樣性、改善菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)。