王玲玲， 陳蘭英*， 馬惠苗， 謝欣序， 劉榮華

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以肺功能障礙和持續(xù)的氣流受限為特征的阻塞性肺疾病，通常與肺的慢性炎癥反應(yīng)升高有關(guān)，其癥狀包括咳嗽、痰和呼吸困難。吸煙是COPD的主要觸發(fā)因素[1]，在煙草最為流行的發(fā)展中國(guó)家，被診斷為慢性阻塞性肺病的患者預(yù)計(jì)將持續(xù)增加，這就需要新的疾病治療方法。臨床上治療COPD的藥物主要是糖皮質(zhì)激素或支氣管擴(kuò)張劑等，這些藥物主要是通過(guò)聯(lián)合作用來(lái)控制患者癥狀，且取得的治療效果不佳，因此有必要研發(fā)一種對(duì)于治療COPD效果好且無(wú)副作用的新藥。

澤漆又名貓兒眼睛草、五朵云、一把傘等，屬大戟科二年生草本植物，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載其具有化痰止咳、利水消腫、散結(jié)殺蟲(chóng)等作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，澤漆具有抑制支氣管腺體中酸性黏多糖合成和使痰量減少的雙重作用，并能促進(jìn)支氣管黏膜上皮炎癥病理的修復(fù)[2]，還具有抗腫瘤、提高機(jī)體的免疫功能[3]的作用。有研究報(bào)道[4]，澤漆片能用于治療COPD急性加重期患者，因此本實(shí)驗(yàn)旨在探索其水提物對(duì)COPD大鼠的治療作用及對(duì)相關(guān)因子的影響。

1 材料

1.1 藥物 澤漆購(gòu)自浙江麗水，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)劉榮華教授鑒定為大戟科大戟屬草本植物澤漆EuphorbiahelioscopiaL.的干燥地上部分。醋酸地塞米松片(批號(hào)1711055)，購(gòu)自天津力生制藥股份有限公司。香煙(焦油量11 mg，煙氣一氧化碳量12 mg)，購(gòu)自江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度60%～70%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為JZLLSC-20190171。

1.3 試劑 脂多糖(批號(hào)L2880)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；C反應(yīng)蛋白(CRP)和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶測(cè)定試劑盒(GGT)(批號(hào)分別為19021402和KR105)購(gòu)自北京利德曼生化股份有限公司；蘇木精和伊紅染色液(批號(hào)分別為H8070和G1100)、 Masson三色染色試劑盒(批號(hào)G1340)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TriZol裂解液(批號(hào)15596026)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)4368814)、SYBR Green PCR Master mix(批號(hào)00710493)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；生理鹽水(批號(hào)1903210103)購(gòu)自浙江都邦藥業(yè)股份有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)(批號(hào)KGB5001)購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；異丙醇(批號(hào)67-63-0)購(gòu)自西隴化工股份有限公司；氯仿(批號(hào)865-49-6)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)核酸酶水(批號(hào)AM9937)購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；無(wú)水乙醇(批號(hào)64-17-5)購(gòu)自西隴化工股份有限公司。

1.4 儀器 日立7100型全自動(dòng)生化分析儀(上海日立高新技術(shù)國(guó)際貿(mào)易有限公司)；WPB PLT-UNR-RT-2型動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)(法國(guó)EMKA公司)；CKX41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；RM2016型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；亞光YB-6LF型生物組織石蠟包埋機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)；SpectraMax I3型多功能酶標(biāo)儀(奧地利MD公司);Centrifuge5810R型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；ABI750型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；Luminex 200型多功能流式點(diǎn)陣儀(美國(guó)Luminex公司)。

2 方法

2.1 澤漆水提物制備 取干燥澤漆全草，按照1∶8料液比置于圓底燒瓶中加熱提取2次，每次2 h，紗布過(guò)濾，合并濾液，減壓回收溶劑濃縮，得稠浸膏(得率為20%)，真空條件下低溫干燥，即得。

2.2 分組、造模及給藥 將72只SD雄性大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組(12只)和模型組(60只)，采用香煙煙霧暴露聯(lián)合氣管內(nèi)滴入LPS方法來(lái)制備COPD大鼠模型[5]。在造模第1、15天，向模型組大鼠氣管內(nèi)滴注0.2 mL 脂多糖(1 mg/mL)，空白組大鼠氣管內(nèi)滴注0.2 mL生理鹽水；在第2～14、16～35天，每天將大鼠放在自制的密閉有機(jī)玻璃熏煙箱(30 cm×40 cm×60 cm)內(nèi)給予被動(dòng)吸煙，2次/d，30 min/次，每次12根香煙(焦油量11 mg，煙氣一氧化碳量12 mg)；空白組大鼠給予呼吸正?？諝?，持續(xù)5周，在造模過(guò)程中有4只大鼠死亡。造模5周后，將模型大鼠隨機(jī)分為模型組，地塞米松組(0.81 mg/kg)，澤漆低、中、高劑量組(生藥1.25、2.5、5 g/kg)，每組12只，除空白組、模型組大鼠灌胃給予蒸餾水外，其余各組大鼠給予藥物治療，容量為10 mL/kg，1次/d，持續(xù)至第28天。

2.3 一般觀察 每天注意觀察各組大鼠的毛發(fā)、活動(dòng)和精神狀態(tài)等情況。

2.4 大鼠血清指標(biāo)檢測(cè) 大鼠每周進(jìn)行1次眼眶采血，于4 ℃、3 000 r/min條件下離心15 min，分離血清并吸取適量(80 μL)置于全自動(dòng)生化儀中，檢測(cè)GGT、CRP水平。

2.5 大鼠肺功能檢測(cè) 在給藥至第28 天，10%水合氯醛麻醉大鼠后，用肺功能儀及呼吸機(jī)連接氣管，待大鼠呼吸穩(wěn)定后測(cè)定并記錄肺功能相關(guān)參數(shù)，包括最大呼氣流量(Maximum expiratory flow,PEF)、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(Pulmonary dynamic compliance,Cdyn)、肺活量(Vital capacity,VC)、第0.1秒用力呼氣容積(Forced expiratory volume in 0.1 second,FEV0.1)、潮氣量(Tidal volume,TV)、呼氣量(Expiratory volume,EV)、每分通氣量(Minute ventilation,MV)、呼出50%潮氣量時(shí)呼氣流速(Expiratory flow rate at 50% tidal volume,EF50)。

2.6 大鼠肺泡灌洗液中炎性因子檢測(cè) 測(cè)完大鼠肺功能參數(shù)后，立即抽取肺泡灌洗液，預(yù)冷PBS沖洗，重復(fù)抽取3次，每次3 mL，使其回收率達(dá)到75%以上，灌洗經(jīng)離心后置于-80 ℃冰箱中保存。采用高通量液相蛋白芯片技術(shù)，檢測(cè)大鼠肺泡灌洗液中白介素-1β(IL-1β)、白介素12(IL-12)、白介素17 A(IL-17A)、白介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素13(IL-13)水平。

2.7 大鼠肺組織及氣管組織病理學(xué)觀察

2.7.1 HE染色法檢測(cè)大鼠肺組織及氣管組織病理學(xué)變化 收集完 BALF 后，剪取大鼠右肺組織或氣管組織，在預(yù)冷PBS中稍作漂洗，吸水紙吸干，剪取大鼠右肺組織上葉或氣管組織，固定4%多聚甲醛溶液中24 h后，脫水處理并包埋于石蠟中，切片厚度為5 μm，經(jīng)蘇木精及伊紅染色、脫水透明、中性樹(shù)膠封固等步驟后，在顯微鏡下觀察。

2.7.2 Masson染色法檢測(cè)大鼠肺組織病理學(xué)變化 剪取大鼠右肺組織，在預(yù)冷PBS中稍作漂洗后固定于4%多聚甲醛溶液中，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片、脫蠟等步驟后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Masson染色操作，最后用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片處理，切片晾干后在顯微鏡下觀察。

2.7.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)檢測(cè)大鼠肺組織mRNA表達(dá) 剪取大鼠右肺組織，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增條件為活化50 ℃ 1 min，1個(gè)循環(huán)；預(yù)變性95 ℃ 3 s，1個(gè)循環(huán)；變性95 ℃ 3 s，退火60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)，以β-actin為內(nèi)標(biāo)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算各組mRNA相對(duì)表達(dá)。所有引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列

3 結(jié)果

3.1 一般觀察 造模開(kāi)始第14天，大鼠出現(xiàn)咳嗽并逐漸加重；第20天后弓背蜷縮，喜歡扎堆，經(jīng)常瞇眼，毛發(fā)灰黃無(wú)光澤并且有部分容易脫落；空白組大鼠不咳嗽，毛發(fā)光澤。給藥7 d后，地塞米松組、澤漆水提物組大鼠咳嗽癥狀減輕；10 d后，大鼠毛發(fā)逐漸變光亮；20 d后，大鼠毛色發(fā)白。與模型組比較，各組大鼠體質(zhì)量呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 澤漆水提物對(duì)大鼠血清中GGT、CRP水平的影響 在給藥期間(第6～9周)，與空白組比較，模型組大鼠(第7、9周)血清中GGT、CRP水平升高(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，第7周澤漆水提物高劑量組大鼠血清中GGT水平降低(P<0.05)，在第7、9周中澤漆水提物組其水平都有不同程度的降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2～3。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

3.3 澤漆水提物對(duì)大鼠肺功能參數(shù)的影響 與空白組比較，模型組大鼠PEF、VC、FEV0.1、MV、EF50、Cdyn、TV、EV、EIP降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組大鼠PEF、FEV0.1、Cdyn升高(P<0.05)，澤漆水提物高劑量組大鼠PEF、 VC、 FEV 、Cdyn升高(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 澤漆水提物對(duì)大鼠肺功能參數(shù)的影響

3.4 澤漆水提物對(duì)大鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-12、IL-17A、TNF-α水平升高(P<0.01)，IL-10、IL-13水平降低(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-12、 IL-17A、TNF-α水平降低(P<0.01)，IL-10、IL-13水平升高(P<0.01)；澤漆水提物各給藥組對(duì)大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-12、IL-17A、TNF-α水平都有不同程度的降低作用，以高劑量組最明顯，見(jiàn)表3。

表3 澤漆水提物對(duì)大鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平的影響

3.5 澤漆水提物對(duì)大鼠肺及氣管組織病理?yè)p傷的影響 空白組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡大小形態(tài)正常；模型組大鼠肺泡之間的間隔斷裂，存在皺縮融合現(xiàn)象，肺泡結(jié)構(gòu)完整性被破壞；與模型組比較，澤漆水提物各給藥組均有不同程度的改善作用，其中地塞米松組和澤漆水提物高劑量組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，見(jiàn)圖4。

圖4 澤漆水提物對(duì)COPD大鼠肺組織中肺泡病理學(xué)變化的影響(HE，×100)

空白組大鼠肺支氣管結(jié)構(gòu)完整，四周少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠的肺支氣管管腔狹窄、皺縮，四周有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺支氣管形狀發(fā)生改變；與模型組比較，澤漆水提物各給藥組均有不同程度的改善作用，其中地塞米松組和澤漆水提物高劑量組大鼠肺支氣管組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著降低，肺支氣管結(jié)構(gòu)較為完整，見(jiàn)圖5。

圖5 澤漆水提物對(duì)COPD大鼠肺組織中肺支氣管病理學(xué)變化的影響(HE，×100)

空白組大鼠肺氣管結(jié)構(gòu)完整，黏膜上皮假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮細(xì)胞排列整齊，杯狀細(xì)胞大小形態(tài)完整；與空白組大鼠比較，模型組大鼠的肺氣管無(wú)顯著性差異；與模型組比較，澤漆水提物各給藥組的肺氣管也無(wú)顯著差異，表明COPD大鼠的病理?yè)p傷主要在小氣道，見(jiàn)圖6。

圖6 澤漆水提物對(duì)COPD大鼠肺氣管組織病理學(xué)變化的影響(HE，×200)

3.6 澤漆水提物對(duì)大鼠肺組織膠原的影響 隨機(jī)選取6個(gè)區(qū)域，在100倍鏡下觀察大鼠肺組織Masson染色圖，利用Image J軟件對(duì)各組大鼠膠原纖維的面積進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)空白組大鼠肺支氣管結(jié)構(gòu)完整，四周僅有少量呈絲狀沉積；與空白組比較，模型組大鼠的肺支氣管管腔狹窄，肺支氣管四周有較多膠原沉積(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組及澤漆水提物低、高劑量組上述膠原沉積得到不同程度的改善(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表4、圖7。

表4 澤漆水提物對(duì)大鼠肺組織膠原纖維化面積百分比的影響

圖7 澤漆水提物對(duì)COPD大鼠肺組織Masson染色的影響(×100)

3.7 澤漆水提物對(duì)大鼠肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)相關(guān)mRNA表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺組織中MMP-2、MMP-12 mRNA表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01)，而TIMP-2 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松、澤漆水提物各給藥組MMP-2、MMP-12 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，表明澤漆水提物各給藥組能降低MMP-2/TIMP-2值(P<0.01)。與空白組比較，模型組大鼠肺組織中MMP-9 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，而TIMP-1 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組MMP-9、TIMP-1 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，澤漆水提物中劑量組中MMP-9 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，澤漆水提物各給藥組TIMP-1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，表明澤漆水提物各給藥組能升高M(jìn)MP-9/TIMP-1值 (P<0.01)，見(jiàn)圖8。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

與空白組比較，模型組大鼠肺組織中IL-6、TGF-β1 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組IL-6、TGF-β1 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，澤漆水提物各給藥組IL-6、TGF-β1 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，見(jiàn)圖9。

注：與空白組比較， ##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

3.8 澤漆水提物對(duì)大鼠肺組織Th1的IL-12/STAT4信號(hào)通路中相關(guān)mRNA表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺組織中T-bet、IL-12、STAT4 mRNA表達(dá)升高(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組T-bet、IL-12、STAT4 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，澤漆水提物低、中劑量組T-betmRNA表達(dá)降低(P<0.01)，澤漆水提物各給藥組中IL-12、STAT4 mRNA表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖10。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.9 澤漆水提物對(duì)大鼠肺組織Th2的IL-4/STAT6信號(hào)通路中相關(guān)mRNA表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠肺組織中GATA-3、IL-4、STAT6 mRNA表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組GATA-3、STAT6 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，澤漆水提物各給藥組GATA-3 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，澤漆水提物低劑量組IL-4、STAT6 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，高劑量組IL-4 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，見(jiàn)圖11。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

根據(jù)大鼠肺組織Th1的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子T-Bet和Th2的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的數(shù)據(jù)，并統(tǒng)計(jì)T-Bet與Th2、IL-4與IL-12、STAT4與STAT6之間的比值，發(fā)現(xiàn)澤漆水提物低、中劑量組可通過(guò)調(diào)節(jié)COPD大鼠Th1/Th2之間的平衡關(guān)系來(lái)達(dá)到抗炎作用，見(jiàn)圖12。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以氣流受限為特征的一種不可逆疾病，通常與肺部慢性炎癥反應(yīng)升高有關(guān)[6]。慢性炎癥會(huì)導(dǎo)致氣道壁增厚、肺泡分離、氣道-實(shí)質(zhì)相互依賴減少進(jìn)而導(dǎo)致管腔狹窄[7]。本實(shí)驗(yàn)采用香煙煙霧暴露聯(lián)合模擬細(xì)菌感染產(chǎn)生的內(nèi)毒素來(lái)制備COPD大鼠模型，研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺功能參數(shù)下降、氣道狹窄、肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺支氣管膠原沉積等這些病理組織學(xué)變化都證實(shí)COPD大鼠模型制備成功。給藥組大鼠肺功能參數(shù)及組織病理學(xué)變化都得到明顯改善，這表明澤漆對(duì)COPD大鼠具有一定的藥效。

血清成分含有多種判斷肺損傷的標(biāo)志物，肺損傷時(shí)血清GGT活性和CRP水平均明顯升高[8-9]。此外，CRP和GGT也與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[8,10]。本研究結(jié)果顯示地塞米松組及澤漆給藥組能明顯降低大鼠血清中CRP水平，對(duì)GGT有一定的降低作用，提示澤漆減輕COPD大鼠的炎癥反應(yīng)。

TGF-β1是一種重要的致纖維化細(xì)胞因子，上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞能釋放TGF-β1，從而觸發(fā)纖維母細(xì)胞增生導(dǎo)致組織重構(gòu)[11]。有研究表明TGF-β1能通過(guò)促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的作用從而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)的活性，從而刺激成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成并釋放促炎和致纖維化細(xì)胞因子，進(jìn)而參與肺纖維化的形成，減少膠原的降解[12]，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)肺組織纖維化時(shí)，肺組織間質(zhì)有大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)堆積，會(huì)導(dǎo)致MMP/TIMP系統(tǒng)發(fā)生紊亂。本研究結(jié)果顯示，模型組中TIMP-1 mRNA表達(dá)升高，而MMP-9 mRNA表達(dá)降低，這表明模型組大鼠的MMP-9/TIMP-1系統(tǒng)功能出現(xiàn)異常，進(jìn)而導(dǎo)致ECM增多。澤漆降低大鼠肺組織中TGF-β1、TIMP-1 mRNA表達(dá)而升高M(jìn)MP-9的mRNA表達(dá)，這表明澤漆能通過(guò)降低TGF-β1、調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1平衡系統(tǒng)，減少肺組織中膠原的沉積，進(jìn)而改善COPD大鼠肺組織纖維化。

MMPs可被吸煙或氧化應(yīng)激激活[13]，最終導(dǎo)致MMPs表達(dá)上調(diào)如MMP-2和MMP-12等[14]。TIMPs是MMPs的抑制劑，能阻止MMPs裂解ECM組分[15]。促蛋白水解因子和抗蛋白水解因子及其特異性抑制劑的平衡表達(dá)維持了細(xì)胞外基質(zhì)周轉(zhuǎn)的平衡。本研究結(jié)果顯示地塞米松及澤漆能降低MMP-2、MMP-12和MMP-2/TIMP-2值，這表明澤漆能通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2之間平衡關(guān)系從而減輕大鼠肺纖維化的進(jìn)程。

COPD是一種與異常免疫反應(yīng)有關(guān)的炎癥反應(yīng)，淋巴細(xì)胞參與慢性阻塞性肺病的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[16]。在不同的細(xì)胞因子刺激下，CD4+T細(xì)胞向Th1和Th2細(xì)胞分化。在其分化和功能上Th1/Th2是一對(duì)互相制約的平衡系統(tǒng)，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)免疫平衡發(fā)揮著重要作用，一旦這種平衡被打破，就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展[8]，Thl/Th2反應(yīng)失調(diào)與多種慢性氣道炎癥有關(guān)。本研究結(jié)果顯示地塞米松和澤漆能明顯降低大鼠肺泡灌洗液中由Th1細(xì)胞中分泌的IL-12、TNF-α、IL-1β的水平，這表明澤漆能通過(guò)降低Th1細(xì)胞的促炎免疫反應(yīng)從而調(diào)節(jié)Th1/Th2之間的平衡關(guān)系進(jìn)而起抗炎作用。

轉(zhuǎn)錄蛋白(STAT)是由一系列胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子組成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和激活子，通過(guò)調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程發(fā)揮重要作用[17]。STAT4在IL-12與受體結(jié)合后被激活，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h1細(xì)胞。IL-4能激活STAT6誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h2細(xì)胞。有研究表明，STAT4參與了吸煙誘導(dǎo)的小鼠肺小氣道重塑的發(fā)展，并指出STAT4的異常表達(dá)調(diào)控了基質(zhì)生成和氣道成纖維細(xì)胞表型[18]。此外，Th1細(xì)胞從CD4+T細(xì)胞的分化與IL-12/STAT4通路的激活有關(guān)，Th2細(xì)胞從CD4+T細(xì)胞的分化與IL-4/STAT6通路的激活有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示地塞米松和澤漆能降低IL-12、T-bet及STAT4的mRNA的表達(dá)從而抑制Th1的免疫亢進(jìn)，起抗炎免疫調(diào)節(jié)作用。地塞米松組降低了IL-4 mRNA表達(dá)，而升高GATA-3及STAT6的mRNA表達(dá)，這說(shuō)明在取材的這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，地塞米松組大鼠已經(jīng)比澤漆提前進(jìn)入了轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程，這可能是地塞米松和澤漆的作用時(shí)間點(diǎn)不一致所致。澤漆能升高IL-4、GATA-3及STAT6的mRNA表達(dá)及從而增強(qiáng)Th2的免疫功能。根據(jù)大鼠肺組織Th1的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子T-Bet和Th2的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA-3兩者間的比值， IL-4和IL-12兩者的比值及STAT4、STAT6兩者的比值關(guān)系得出，澤漆可通過(guò)降低T-bet/GATA-3、IL-12/IL-4和STAT4/STAT6的比值從而調(diào)節(jié)COPD大鼠Th1/Th2之間的平衡關(guān)系而起抗炎免疫調(diào)節(jié)作用。

上述結(jié)果表明，澤漆可能通過(guò)抑制Th1中IL-12/STAT4通路的激活并促進(jìn)Th2中IL-4/STAT6通路的激活來(lái)調(diào)節(jié)Th1/Th2之間的平衡關(guān)系，從而對(duì)COPD大鼠起抗炎作用。當(dāng)機(jī)體的炎癥介質(zhì)和抗炎介質(zhì)保持平衡時(shí)，身體保持健康狀態(tài)。當(dāng)這種平衡轉(zhuǎn)向炎癥介質(zhì)時(shí)，器官、組織或細(xì)胞將觸發(fā)炎癥反應(yīng)。因此，糾正炎癥與抗炎癥的不平衡是治療慢性阻塞性肺病的策略之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為澤漆在治療COPD的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為開(kāi)發(fā)抗COPD的藥物奠定了基礎(chǔ)。