李 運(yùn)， 王 苗， 張國強(qiáng)， 邱國玉， 石曉峰， 戴 忠

(1.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院/甘肅省種植中藥材外源性污染物監(jiān)測工程研究中心，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州 730050；5.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

通宣理肺丸由紫蘇葉、前胡、桔梗等11味藥材組成[1]，方中君藥紫蘇葉、麻黃辛溫宣肺，發(fā)散風(fēng)寒；臣藥前胡、桔梗輔助君藥宣通肺氣，杏仁潤肺止咳，半夏、陳皮、茯苓燥濕化痰；佐以黃芩清肺以防肺氣郁久化熱，枳殼行氣消痰；甘草為使藥，調(diào)和諸藥，全方共奏通宣理肺之功效，臨床應(yīng)用較廣，但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能較全面的對其質(zhì)量進(jìn)行控制。因此，需借鑒指紋圖譜[2]、特征圖譜[3]、多成分測定[4-5]、數(shù)理統(tǒng)計(jì)[6]等方法，充分體現(xiàn)中藥整體或部分化學(xué)特性的譜圖，最大限度地表征藥效相關(guān)成分或特征成分[7]，從而在中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)中發(fā)揮重要的作用。

近年來，有學(xué)者對通宣理肺丸中橙皮苷、柚皮苷[8]、黃芩苷[9]、鹽酸麻黃堿[10]、白花前胡甲素、白花前胡乙素[11]含量進(jìn)行了測定；姚蓉等[12]篩查了前胡投料情況，并對其特征成分含量進(jìn)行測定；孫國祥等[13]采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳，建立全方指紋圖譜。本實(shí)驗(yàn)在前期報(bào)道及劉昌孝院士[14-15]提出“中藥質(zhì)量標(biāo)志物”概念的基礎(chǔ)上，選擇與中藥質(zhì)量特性密切相關(guān)的標(biāo)志物，建立通宣理肺丸HPLC指紋圖譜，并對甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、白花前胡甲素含量進(jìn)行測定，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695液相色譜儀(美國Waters公司)；SBL-10DT超聲波恒溫清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；XSE205DU電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q IQ7000超純水機(jī)(美國默克密理博公司)；ChemPattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件[科邁恩(北京)科技有限公司]。

1.2 試劑與藥物 甘草苷(批號(hào)111610-201908，純度95%)、柚皮苷(批號(hào)110722-201815，純度91.7%)、橙皮苷(批號(hào)110721-202019，純度95.3%)、新橙皮苷(批號(hào)111857-201804，純度99.4%)、甘草酸銨(批號(hào)110731-201619，純度96.2%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；黃芩苷(批號(hào)8369，純度96.2%)、白花前胡甲素(批號(hào)5636，純度99.2%)對照品均購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司。通宣理肺丸(大蜜丸)31批，編號(hào)S1～S31，具體見表1。乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑為分析純；純化水為實(shí)驗(yàn)室自制。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 CAPCELL PAK C18MG色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相水(含0.1%甲酸)(A)-80%乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，15%B；5～10 min，15%～20%B；10～20 min，20%～25%B；20～30 min，25%B；30～40 min，25%～48%B；40～45 min，48%～70%B；45～55 min，70%～90%B；56～60 min，90%～15%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長250 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，即得(甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、白花前胡甲素質(zhì)量濃度分別為1.003 2、0.989 4、0.582 3、1.064 6、0.575 3、1.335 3、1.174 5 mg/mL)，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液 取樣品(S3)適量，剪碎，混勻，取約1 g，精密稱定，加硅藻土1 g，研勻，置于150 mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇25.00 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，靜置冷卻，70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例及工藝，分別制得缺甘草，缺陳皮，缺陳皮、枳殼，缺黃芩，缺前胡，缺甘草、黃芩、前胡、陳皮、枳殼的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取樣品(S3)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次，以18號(hào)峰(黃芩苷)為參照，測得各共有峰相對保留時(shí)間 RSD為0.052%～0.501%，相對峰面積RSD為0.856%～2.650%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品(S3)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以18號(hào)峰(黃芩苷)為參照，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD為0.026%～1.000%，相對峰面積RSD為1.017%～2.498%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品(S3)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以18號(hào)峰(黃芩苷)為參照，測得各共有峰相對保留時(shí)間RSD為0.035%～1.638%，相對峰面積RSD為1.005%～2.826%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 圖譜生成 取31批樣品(S1～S31)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入ChemPattern軟件，設(shè)置積分條件(斜率0.01，最小相對峰高0.1%，最小百分比峰面積0.25%，積分開始3，積分結(jié)束300)，以75%(高四分位數(shù))為共有峰篩選條件，采用高斯曲線模擬生成共有模式，發(fā)現(xiàn)39個(gè)共有峰，見圖2。

圖1 31批樣品HPLC指紋圖譜

10.甘草苷 13.柚皮苷 14.橙皮苷 15.新橙皮苷 18.黃芩苷 30.甘草酸 39.白花前胡甲素 10.liquiritin 13.naringin 14.hesperidin 15. neo-hesperidin 18.baicalin 30. glycyrrhizic acid 39.praeruptorin A

2.3.5 相似度分析 采用ChemPattern軟件，以HPLC指紋圖譜共有模式為參照圖譜，通過夾角余弦法計(jì)算各樣品相似度，見表2，可知相似度為0.16～0.99，其中有77.4%大于0.95，表明不同企業(yè)樣品質(zhì)量差異較大，其中Y2、Y3企業(yè)有3批低于0.6，均存在部分特征峰丟失或者峰面積偏小的情況。

表2 31批樣品相似度

2.3.6 聚類分析 采用ChemPattern軟件將31批樣品HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，以街區(qū)距離為度量，通過遠(yuǎn)鄰法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。

圖3 31批樣品聚類分析圖

2.3.7 主成分分析 采用ChemPattern軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖4。由此可知，第一主成分(PC1)、第二主成分(PC2)、第三主成分(PC3)貢獻(xiàn)率分別為65.13%、25.64%、3.99%，總計(jì)94.76%，能較好地反映各批樣品之間的差異；峰18、3、28、1、14、33、12、25、39是主要標(biāo)志性成分，與對照品圖譜比對，可知峰14為橙皮苷，峰18為黃芩苷，峰39為白花前胡甲素。

圖4 31批樣品主成分分析圖

2.4 含量測定

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖5。由此可知，各成分分離度良好，丸劑中其他共存物質(zhì)對測定結(jié)果無干擾，理論塔板數(shù)以黃芩苷(5號(hào)峰)計(jì)，不得低于6 000。

1.甘草苷 2.柚皮苷 3.橙皮苷 4.新橙皮苷 5.黃芩苷 6.甘草酸 7.白花前胡甲素

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下對照品溶液(甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、白花前胡甲素質(zhì)量濃度分別為100.32、98.94、58.23、106.46、57.53、133.53、117.45 μg/mL)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、白花前胡甲素峰面積RSD分別為2.8%、2.3%、1.7%、0.6%、0.4%、0.8%、1.7%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(S3)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下別進(jìn)樣測定，測得甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、白花前胡甲素含量RSD分別為1.88%、2.15%、2.02%、1.93%、1.78%、1.45%、2.19%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品(S3)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、白花前胡甲素峰面積RSD分別為2.49%、2.32%、2.00%、2.12%、1.05%、1.24%、2.08%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的樣品(S3)0.5 g，共6份，加入對照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、白花前胡甲素平均加樣回收率分別為99.89%、113.3%、101.2%、105.2%、93.10%、98.10%、106.6%，RSD分別為2.29%、2.58%、2.52%、1.61%、3.86%、1.25%、2.41%。

2.5 樣品含量測定 取31批樣品，每批2份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含量測定結(jié)果(%，n=3)

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

3.1.1 流動(dòng)相 本實(shí)驗(yàn)考察了90%乙腈-水(含0.2%磷酸)、80%乙腈-水(含0.2%磷酸)、80%乙腈-水(含0.1%甲酸)，發(fā)現(xiàn)80%乙腈-水(含0.1%甲酸)梯度洗脫60 min時(shí)，各成分色譜峰峰形較好。

3.1.2 檢測波長 本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測器對各成分進(jìn)行全波長掃描，綜合考慮不同吸收波長處的圖譜響應(yīng)強(qiáng)度，最終確定250 nm作為檢測波長，此時(shí)各成分檢測靈敏度較好，干擾小。

3.2 提取條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取方法(超聲、回流)、提取溶劑(70%乙醇、70%甲醇、甲醇)、提取時(shí)間(30 min、1 h、1.5 h)，結(jié)合綠色分析的需要，最終確定25 mL 70%乙醇超聲提取30 min作為提取條件。

3.3 含量測定分析 企業(yè)Y1、Y4、Y5、Y6、Y7樣品之間的相似度均大于0.95，質(zhì)量均一性良好；Y2、Y3不同批次及同一批次樣品之間存在較大差異。31批樣品中，甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、白花前胡甲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為0.001 2%～0.063 1%、0.083 8%～0.209 8%、0.007 1%～0.258 4%、0.051 4%～0.207 7%、1.43%～4.31%、0.046 4%～0.087 9%、0.013 1%～0.046 1%，差異較明顯，故對通宣理肺丸質(zhì)量的整體控制方法有待進(jìn)一步完善。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了通宣理肺丸HPLC指紋圖譜，并同時(shí)測定了甘草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、甘草酸、白花前胡甲素含量，發(fā)現(xiàn)指紋圖譜結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計(jì)能很好地從整體上表征該制劑特性，而且該方法簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，可為其質(zhì)量控制提供參考。