馬 開(kāi)， 辛玉鳳， 田 萍， 位恒超， 祝俠麗， 劉雅敏， 韓德恩,3*

(1.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450046)

大黃素是一種游離型蒽醌化合物，為大黃主要化學(xué)成分之一[1]，具有抗炎[2-3]、鎮(zhèn)痛[4]、抗菌[5]、抗腫瘤[6]、保護(hù)器官[7]等多種藥理作用，但該成分具有水溶性差、半衰期短、生物利用度低等缺點(diǎn)[8]，從而限制了其臨床應(yīng)用。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體是在固體脂質(zhì)納米粒的基礎(chǔ)上，以固體和液體混合脂質(zhì)為載體制備的新型納米載藥系統(tǒng)，它克服了后者載藥量低、貯存過(guò)程中藥物易泄漏等缺陷[9]，不僅具有生物兼容性良好、藥物生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)，還有著緩釋靶向作用[10]，同時(shí)藥物藥動(dòng)學(xué)和組織分布也會(huì)發(fā)生顯著變化[11-13]，開(kāi)發(fā)前景良好。

課題組前期已對(duì)大黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備工藝進(jìn)行優(yōu)化[14]，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上灌胃給予大鼠該制劑，采用超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿及各組織中該成分血藥濃度，考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及組織分布，以期為相關(guān)制劑后續(xù)開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

超高效液相色譜-四級(jí)桿軌道肼高分辨質(zhì)譜儀(UPLC-Q-Orbitrap HRMS，美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；MS105DU電子分析天平(十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；UPD-Ⅱ-107優(yōu)普超純水機(jī)(成都超純科技有限公司)；VORTEX3旋渦混勻器(德國(guó)IKA公司)；JW-3021HR高速冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；EFAA-DC24-RT氮吹儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。

大黃素、甲基異茜草素(批號(hào)分別為wkq16071004、wkq18012405，純度>98%，四川省維克奇生物科技有限公司)；肉豆蔻酸異丙酯(批號(hào)N18100621)、單硬脂酸甘油酯(批號(hào)N18051206)、大豆卵磷脂(批號(hào)N18061105)、泊洛沙姆188(批號(hào)N18110725)均購(gòu)自南京都萊生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]。

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(235±20)g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(魯)20190003，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)1周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲得河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備 參考文獻(xiàn)[14]報(bào)道，精密稱(chēng)取3.27 mg大黃素、200.00 mg單硬脂酸甘油酯、148.68 mg肉豆蔻酸異丙酯，加入少量無(wú)水乙醇助溶，65 ℃下加熱熔融，揮干乙醇，作為油相；精密稱(chēng)取100.00 mg大豆卵磷脂、173.48 mg泊洛沙姆188，水浴加熱至60 ℃，作為水相，磁力攪拌(1 000 r/min)下將水相趁熱滴加到乙醇揮盡的油相中，制成O/W型初乳，迅速用探頭超聲30 min(每工作2 s停止2 s)，冰水浴冷卻固化，定容至20 mL，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2 對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取大黃素對(duì)照品5.20 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇超聲溶解并定容至刻度，精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成5.2 μg/mL貯備液，甲醇稀釋至1.04、2.08、5.20、10.40、20.80、52.00、104.00、520.00、1040.00 ng/mL，即得。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱(chēng)取甲基異茜草素對(duì)照品4.67 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇超聲溶解并定容至刻度，制成46.7 μg/mL貯備液，精密量取0.5 mL，置于100 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得(質(zhì)量濃度為0.233 μg/mL)，4 ℃下冷藏備用。

2.3 分析條件

2.3.1 色譜 Waters ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相0.1%甲酸-乙腈(15∶85)；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源(ESI)，選擇性離子監(jiān)測(cè)模式(SIM)；噴霧電壓3.0 kV；離子傳輸管溫度350 ℃；加熱器溫度300 ℃；鞘氣體積流量35 arb，輔助氣體積流量10 arb；碰撞能量45 V；定量離子(大黃素)m/z269.045 1；內(nèi)標(biāo)(甲基異茜草素)m/z253.049 8。

2.4 生物樣本前處理 精密吸取50 μL血漿，置于1.5 mL離心管中，加入50 μL 0.233 μg/mL內(nèi)標(biāo)(甲基異茜草素)溶液，渦旋混合30 s，再加入400 μL蛋白沉淀劑(甲醇)，渦旋混合3 min，12 000 r/min 離心5 min，取300 μL上清液，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00 μL甲醇復(fù)溶，12 000 r/min離心5 min，取上清液。

取組織樣品1 g，加入3 mL 0.9% NaCl溶液進(jìn)行勻漿，精密吸取勻漿液50 μL，置于1.5 mL離心管中，加入50 μL 0.233 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合30 s，再加入400 μL蛋白沉淀劑(甲醇)，渦旋混合3 min，12 000 r/min 離心5 min，取300 μL上清液，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00 μL甲醇復(fù)溶，12 000 r/min離心5 min，取上清液，待測(cè)。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取空白血漿/組織勻漿樣品、含藥血漿/組織勻漿樣品(2.6 ng/mL大黃素)、給藥1 h后血漿/組織勻漿樣品加內(nèi)標(biāo)(甲基異茜草素)溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，血漿、組織樣品中無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)或其他雜質(zhì)干擾，專(zhuān)屬性良好，可滿足生物樣品測(cè)定要求。

2.5.2 線性關(guān)系考察 取50 μL大鼠空白血漿/組織勻漿樣品9份，加入“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各50 μL，制成含0.5、1.0、2.6、5.2、10.0、26.0、52.0、260.0、520.0 ng/mL大黃素的樣品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定；質(zhì)控樣品制備方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線，低、中、高質(zhì)量濃度分別為2.6、26.0、260.0 ng/mL。以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 大鼠血漿/組織中大黃素線性關(guān)系

2.5.3 準(zhǔn)確度、精密度試驗(yàn) 取2.6、26.0、260.0 ng/mL質(zhì)控樣品溶液各5份，連續(xù)3 d在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2，可知該方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，符合生物樣品檢測(cè)要求。

表2 大黃素準(zhǔn)確度、精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.6、26.0、260.0 ng/mL質(zhì)控樣品溶液各5份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別考察大黃素在-20 ℃下反復(fù)凍融3次、-80 ℃下冷凍保存30 d、室溫下放置12 h的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表3，可知該方法穩(wěn)定性良好，符合生物樣品檢測(cè)要求。

表3 大黃素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5.5 提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 取2.6、26.0、260.0 ng/mL質(zhì)控樣品溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得峰面積A；取空白血漿/組織適量，按“2.4”項(xiàng)下方法處理(不加內(nèi)標(biāo))，上清液中加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得峰面積B；向50%乙腈中加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)溶液，在“2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，得峰面積C，以(A/B)×100%計(jì)算提取回收率，(B/C)×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表4，可知提取回收率良好，基質(zhì)效應(yīng)范圍97.3%～101.3%，符合生物樣品檢測(cè)要求。

表4 大黃素提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究 12只大鼠隨機(jī)分成2組，每組6只，給藥前12 h禁食不禁水，1組灌胃給予大黃素混懸劑，劑量為10 mg/kg，另1組灌胃給予相同劑量大黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體混懸劑，于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h眼眶靜脈竇取血各約0.3 mL，血液樣品置于預(yù)先肝素化的1.5 mL離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上層血漿，采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS法測(cè)定大黃素血藥濃度，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線，見(jiàn)圖2。再通過(guò)DAS 2.0軟件進(jìn)行非房室模型擬合，SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表5，可知納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體Cmax是原料藥的1.39倍，相對(duì)生物利用度為182.98%，同時(shí)t1/2、MRT延長(zhǎng)(P<0.01)，有助于發(fā)揮其長(zhǎng)效緩釋作用。

表5 大黃素主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖2 大黃素血藥濃度-時(shí)間曲線

2.7 體內(nèi)組織分布研究 取24只大鼠，按“2.6”項(xiàng)下方法分組給藥，分別于灌胃0.5、1.5、3、6 h后腹腔注射水合氯醛麻醉，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只，再立即處死，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟，生理鹽水洗滌至各組織表面無(wú)血色，濾紙將水分吸干，置于冷凍管中，液氮速凍15 min，-80 ℃下保存待用，采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS法測(cè)定大黃素含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，大黃素含量在肝臟中最高，其次在肺臟中，脾臟中最低；大鼠給予原料藥0.5 h后，該成分在肝臟中的含量高于給予納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體后，隨著時(shí)間的推移逐漸逆轉(zhuǎn)，而且后者下降速度明顯慢于前者，表明納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在大鼠肝臟中具有一定的緩釋靶向作用。

圖3 大鼠各組織中大黃素含量

3 討論

血漿樣品常用的前處理方法有液-液萃取、固相萃取、蛋白沉淀，其中蛋白沉淀重復(fù)性好，成本較低，是蒽醌類(lèi)成分生物樣品預(yù)處理的常用手段[15-16]。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯對(duì)大黃素的提取回收率的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇去除蛋白時(shí)雜質(zhì)干擾少，提取回收率較高，符合生物樣品測(cè)定要求。

藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，大黃素混懸液Cmax為75.81 ng/mL，而其納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體為105.77 ng/mL，可能是因?yàn)榧{米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑較小，增加了與胃腸道黏膜的接觸面積，有利于藥物吸收；在大黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中加入磷脂、泊洛沙姆188時(shí)，可提高胃腸道黏膜通透性，促進(jìn)藥物吸收[17]，從而增加Cmax；兩者AUC0～∞分別為398.56、729.27 ng/mL·h，相對(duì)生物利用度為182.98%，表明藥物吸收程度大大提高；兩者t1/2分別為9.06、2.36 h，體現(xiàn)了大黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的緩釋效應(yīng)。