董 立，付 麗，張 曦，謝 樂*

(1山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東 臨沂 276000；2臨沭縣婦幼保健院；3山東醫(yī)專附屬醫(yī)院)

胃癌是我國常見的、位居第二的癌癥，早期患者診出率低，初次發(fā)現(xiàn)者多為中晚期，5年生存率約在2%。因此，在分子水平甚至基因水平上探討胃癌的發(fā)病機(jī)制對改善其治療效果具有重要意義，本研究對此進(jìn)行了相關(guān)探討。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2019 年3月—2020年8月本院收治的35例胃癌患者作為觀察組，患者均經(jīng)組織病理學(xué)確診，其中男23例，女12例；年齡29～63(35.18±10.52)歲，其中年齡≥45歲者24人，年齡<45歲者11人。同期選取28例胃炎患者為對照組，患者均經(jīng)臨床和實驗室檢查確診，其中男15例，女13例；年齡22～53(34.87±8.96)歲。兩組年齡及性別比均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往胃部手術(shù)史者；長期酗酒者；患免疫系統(tǒng)或內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；服用免疫抑制劑者；服用抗幽門螺桿菌治療者。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 兩組患者空腹8～12 h后，采集約3 ml靜脈血，注入含EDTA-K2試管中，隨即混勻6次，分離單個核細(xì)胞(PBMC)，用PBS緩沖液清洗3遍，-80℃冰箱凍存待測。

1.2.2檢測方法 提取上述標(biāo)本中的RNA，然后用紫外分光光度計測定其純度，A260/A280比值應(yīng)處于1.8～2.0。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后出現(xiàn)3條清晰核酸條帶，說明RNA提取效率較好。然后，取上述提純后的RNA樣品5 μg，分別加入OLigo(dT)primer(0.5 g/L)1 μL，DEPC處理水，至終體積均為12 μl，然后在70℃條件下水浴5 min。冰上驟冷后，加5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液7 μl，加RNA 酶抑制劑20 U，加dNTPs 4μl，40℃水浴5 min后置于冰上，加入逆轉(zhuǎn)錄酶200 U，反應(yīng)體系總體積28μl，42℃反應(yīng)68 min，最后70℃下放置15 min終止。將所獲cDNA于-80℃冰箱凍存待測。建立PCR檢測體系，該體系總體積為25μl，包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μl，20μmoL/L上、下游引物各1μl，引物序列見表1，2.5 mmoL/LdNTP 5μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液5μl，25 mmol/L的MgCl24μl，TaqDNA聚合酶2 U，其余以DEPC水補(bǔ)至25μl。Livin的擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；94℃變性42 s，62℃復(fù)性40 s；72℃延伸55 s，35個循環(huán)。最后72℃延伸5 min。MDR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；94℃變性46 s，60℃復(fù)性45 s；72℃延伸50s，32個循環(huán)。最后72℃延伸7min。最后采用2%瓊脂糖凝膠對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳(75V，45 rain)分析，在紫外透射儀下觀察。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1兩組Livin及MDR基因表達(dá)的比較 Livin基因：觀察組陽性率為54.29%(19/35)，對照組為14.29%(4/28)，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.08，P=0.003)。MDR基因：觀察組的陽性率為71.4%(25/35)，對照組為17.8%(5/28)，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.81，P<0.01)。

2.2胃癌患者Livin及MDR表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系 Livin、MDR的表達(dá)與組織分化程度有關(guān)；Livin與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。見下表2。

表2 胃癌患者Livin及MDR的表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.3胃癌患者Livin與MDR表達(dá)相關(guān)性分析 在胃癌患者樣本中，Livin與MDR的表達(dá)無明顯相關(guān)性(r=-0.200，P=0.251)。見表3。

表3 胃癌組織Livin與MDR表達(dá)相關(guān)性分析

3 討論

Livin基因定位于人類染色體的10q23.3，全長218 kb，有9個外顯子，8個內(nèi)含子，其主要結(jié)構(gòu)功能區(qū)位于N端，編碼蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為56 000，分布在胞質(zhì)中。有研究顯示，Livin在大多數(shù)正常成人中幾乎不表達(dá)，而在多數(shù)實體腫瘤中呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平，主要通過與caspase-3/-7/-9結(jié)合，阻斷與caspase高度相關(guān)的死亡受體途徑和線粒體途徑[1]。本研究證實，胃癌患者中的Livin表達(dá)明顯升高，分化程度較差者及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性表達(dá)更高，與患者的年齡、性別無關(guān)。

MDR1是非常重要的細(xì)胞耐藥基因，可產(chǎn)生單向藥物外輸?shù)鞍譖-gp，該蛋白由ATP提供能量，可將細(xì)胞內(nèi)某些成分轉(zhuǎn)移出細(xì)胞外，如代謝廢物、某些藥物等，從而保護(hù)細(xì)胞免受毒物及代謝產(chǎn)物損害；同樣，P-gp可增加細(xì)胞內(nèi)抗腫瘤藥物的外運，導(dǎo)致其濃度下降。該基因在體內(nèi)激活后，將導(dǎo)致腫瘤治療效果變差[2-3]。因此，MDR1的監(jiān)測可以作為評價腫瘤細(xì)胞耐藥的指標(biāo)。本研究證實，胃癌患者中的MDR呈高表達(dá)狀態(tài)，與腫瘤組織分化程度有關(guān)，但與是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的年齡、性別無關(guān)。

總之，隨著科學(xué)研究的不斷深入，對胃癌高危人群進(jìn)行Livin和MDR等基因檢測越來越成為可能，從而提高胃癌的早期檢出率。本研究樣本量較小，對胃癌生物學(xué)行為劃分較粗，還需要進(jìn)一步開展對胃癌分化程度、浸潤程度、預(yù)后評價及臨床治療的研究。