李 旭 劉國力

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(遼寧 沈陽 110000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD),是一種與年齡相關(guān),且以記憶障礙、失語、視空間機(jī)能損害及行為異常等為特征的神經(jīng)退行性疾病。主要病理學(xué)特征為神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)由過度磷酸化tau蛋白聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)以及細(xì)胞外存在大量的以β淀粉樣蛋白(amyloid-β protein,Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaque,SP)[1-3]。

研究證實,氧化應(yīng)激是AD發(fā)病的主要病因之一。研究發(fā)現(xiàn),AD小鼠腦內(nèi)過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)能夠?qū)е履ぶ|(zhì)過氧化、突觸功能受損、線粒體損傷等,最終引起神經(jīng)變性死亡[4]。松果菊苷為苯乙醇苷類化合物,其藥理作用主要有抗氧化作用和神經(jīng)保護(hù)作用等[5-7]。研究表明,松果菊苷分子內(nèi)含有多個酚羥基,能結(jié)合體內(nèi)自由基,具有明顯的清除自由基和抗脂過氧化作用[8]。然而,松果菊苷能否通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減少Aβ沉積數(shù)量進(jìn)而緩解AD發(fā)病尚未見報道。本實驗通過給予AD小鼠腹腔注射松果菊苷2個月后,采用Western blot的方法考察兩組小鼠腦內(nèi)SOD1的蛋白表達(dá)水平,檢測ROS和SOD活性探討松果菊苷對AD模型鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響,同時,利用免疫熒光染色的實驗方法檢測兩組小鼠腦內(nèi)Aβ老年斑的含量變化,行為學(xué)實驗考察松果菊苷能否通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)而改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,最終緩解AD小鼠發(fā)病進(jìn)程的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 藥品和試劑盒 松果菊苷(中國成都瑞芬思生物科技有限公司);β-Amyloid Antibody,SOD1,β-actin,HRP-labeled goat anti-rabbit IgG(Cell Signaling Technology),Inc.Alexa Fluor 555-labeled goat anti-rabbit IgG、(Danvers,MA,USA);ROS和SOD試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、PVDF膜,蛋白Marker(Thermo)。

1.1.2 實驗儀器 Morris水迷宮(江蘇淮北正華,中國),冰凍切片機(jī),BIO-RAD凝膠圖像分析系統(tǒng),Tanon2500電泳凝膠分析儀,熒光共聚焦顯微鏡,電泳儀,水平搖床,低溫離心機(jī),酶標(biāo)儀等。

1.1.3 實驗動物與分組 5月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠購于美國Jackson Lab(Stock Number 008169),體重約25克,每籠約3～4只,晝夜交替飼養(yǎng),飼養(yǎng)室溫度保持在22～25℃左右。具體分組及給藥方式如下：AD模型組：5月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠10只,每日腹腔注射0.9%NaCl;松果菊苷治療組：5月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠10只,每日給予20mg/kg/d松果菊苷腹腔注射,連續(xù)給藥2個月。

1.2方法

1.2.1 Morris水迷宮 Morris水迷宮實驗是評價AD模型鼠學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知障礙最常用的研究手段,因此,本研究利用Morris水迷宮實驗對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的行為表現(xiàn)進(jìn)行評估。實驗前,將水溫加熱至(25±2)℃。訓(xùn)練期為2天,每天三次,每次間隔30分鐘,定位航行實驗歷時5天,每天3次,每次間隔30分鐘。第8天進(jìn)行空間探索實驗,移走平臺,記錄小鼠穿越原來平臺位置的次數(shù),進(jìn)行3次實驗。

1.2.2 小鼠腦組織取材 各組小鼠進(jìn)行深度麻醉后灌流處死,迅速取出大腦后,從中間矢狀縫切開,大腦左半球放入4%多聚甲醛中固定,用于制備冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色;另一側(cè)放入-80℃保存?zhèn)溆?用于分子生物學(xué)等常規(guī)指標(biāo)檢測。

1.2.3 Western blot檢測 各組小鼠皮層組織分別稱重,按1∶5比例加入蛋白裂解液后進(jìn)行超聲粉碎,4℃裂解3個小時,4℃12000rpm低溫離心15分鐘,吸取上清,BCA蛋白濃度測定。

10%～15% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠,80V恒壓低溫電轉(zhuǎn)2小時,取出膜后用5%脫脂奶粉封閉,一抗4℃孵育過夜,二抗室溫孵育1h,ECL發(fā)光,顯影。以β-actin作為上樣量參照標(biāo)準(zhǔn),用Image-pro Plus 6.0軟件包分析。

1.2.4 免疫熒光染色 冰凍切片血清封閉液封閉1.5小時,一抗4℃孵育過夜。切片經(jīng)PBS充分漂洗后,用熒光二抗室溫孵育2小時,經(jīng)PBS漂洗后,DAPI核染色,PBS漂洗后,防熒光淬滅劑(碧云天)封片,共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察并采集圖像和分析。

1.2.5 活性氧(ROS)測定 稱取各組小鼠大腦皮層組織,溶于冷藏的PBS溶液中,4℃離心15分鐘,吸取上清用于ROS測定。根據(jù)試劑盒說明,進(jìn)行ROS檢測,ROS水平以每微克蛋白的熒光強(qiáng)度表示。

1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測 將皮層稱重,在冷藏的SOD樣品制備液中均質(zhì)。裂解液4℃,4000×g離心15min,吸取上清用于ROS測定。根據(jù)說明書通過紫外分光光度法測定SOD活性。

2 結(jié)果

(1)松果菊苷對AD模型鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響

水迷宮實驗結(jié)果顯示,經(jīng)過2d(3次/d)的訓(xùn)練,APP/PS1小鼠和松果菊苷處理的AD模型鼠在尋找可視平臺的時間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(圖1A),提示各組小鼠的運動能力和視力沒有顯著的差別。在隱蔽平臺實驗中,松果菊苷處理的AD鼠相比于AD模型鼠表現(xiàn)出較短的逃避潛伏期和逃脫距離(圖1B),說明松果菊苷能夠明顯提高小鼠的學(xué)習(xí)能力?？臻g探索實驗提示松果菊苷能夠明顯改善AD模型鼠的空間記憶損傷(圖1C,D)。

圖1 松果菊苷對AD模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響A.可視平臺期內(nèi)檢測各組小鼠的平均逃避潛伏期;B.隱蔽平臺實驗檢測各組小鼠的運動的平均路程;C.空間探索實驗中,各組小鼠經(jīng)過平臺次數(shù)的比較;D.空間探索實驗小鼠的運動軌跡。與AD模型鼠相比,*P<0.05,**P<0.01。

(2)松果菊苷對AD模型鼠皮層中Aβ沉積的影響

應(yīng)用免疫熒光染色的方法檢測兩組小鼠大腦皮層區(qū)Aβ老年斑的沉積數(shù)量。結(jié)果說明,AD模型鼠的大腦皮層均出現(xiàn)大量Aβ陽性神經(jīng)元胞體及陽性老年斑,與AD模型鼠相比,松果菊苷處理組小鼠大腦皮層的老年斑塊數(shù)量明顯減少,并且斑塊體積縮小(圖2)。以上結(jié)果說明松果菊苷能夠通過減少Aβ沉積數(shù)量進(jìn)而緩解AD模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

圖2 皮層區(qū)各組小鼠Aβ老年斑沉積水平

(3)松果菊苷對AD模型小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

研究結(jié)果顯示,與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠相比,松果菊苷處理后可明顯促進(jìn)SOD1蛋白表達(dá),與此同時,松果菊苷可明顯提高SOD活性。除此之外,松果菊苷能夠明顯降低ROS活性。以上結(jié)果顯示,松果菊苷可明顯抑制AD模型鼠腦內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。

3 討論

AD的主要病理特征是神經(jīng)元內(nèi)由過度磷酸化的Tau蛋白聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)以及細(xì)胞外存在的大量的β-淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)聚集形成的老年斑[1-3]。研究表明,Aβ形成過程中會產(chǎn)生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS),而ROS積累過多會產(chǎn)生氧化應(yīng)激,氧化應(yīng)激是指在活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species,RNS)的生產(chǎn)與抗氧化劑之間的嚴(yán)重失衡過程中對生物分子造成的損傷[9]。

圖3 松果菊苷對AD模型鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響A、B Western blot檢測各組小鼠皮層區(qū)SOD1的蛋白變化。C、D各組小鼠腦內(nèi)ROS和SOD活性的比較。與AD模型鼠相比,*P<0.05,**P<0.01。

松果菊苷(Echinacoside,ECH)是種天然化合物,主要從管花肉蓯蓉中提取分離的,具有抗氧化和清除自由基活性的苯乙醇苷類化合物[10]。研究證實,ECH可以提高人體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)以及超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及降低自由基損傷,從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。同時也有研究證實ECH可通過抑制氧化應(yīng)激而保護(hù)神經(jīng)元損傷[11]。除此之外,松果菊苷可通過改善中樞膽堿能系統(tǒng)功能從而促進(jìn)蛋白和核酸合成,并提高小鼠的免疫功能,最終提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[12]。

本實驗通過對氧化應(yīng)激蛋白SOD1表達(dá),以及ROS和SOD活性的檢測,發(fā)現(xiàn)松果菊苷處理后的AD模型鼠與AD組相比,SOD1蛋白表達(dá)升高,活性增強(qiáng),ROS活性降低,這一結(jié)果提示松果菊苷可能通過抑制AD小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)而緩解AD發(fā)病,并且通過免疫熒光實驗方法檢測,我們發(fā)現(xiàn)松果菊苷可減少AD模型鼠腦內(nèi)Aβ沉積數(shù)量,而且水迷宮實驗更進(jìn)一步證實松果菊苷可改善AD模型鼠的認(rèn)知功能,為今后揭開松果菊苷緩解AD發(fā)病提供現(xiàn)實基礎(chǔ)和理論依據(jù)。